這種方法可以檢測(cè)和定量合成類(lèi)mRNA中大多數(shù)修飾的核苷。這不僅包括在體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程中有意通過(guò)三磷酸鹽引入的修飾，還包括商業(yè)化NTP原料變化引入的雜質(zhì)，核苷被氧化產(chǎn)生的雜質(zhì)等。該方法還能檢測(cè)從帽結(jié)構(gòu)釋放的m7G或核糖甲基化修飾。使用LC-MS/MS，可以在核苷水平上分析mRNA，從而在單次運(yùn)行中檢測(cè)和量化數(shù)十種不同的修飾核苷。該方法可以很容易地對(duì)體外轉(zhuǎn)錄的NTP進(jìn)行質(zhì)量控制。

溶液A：5mM醋酸銨緩沖液。乙酸調(diào)pH到5.3

溶液B：乙腈。必須使用LC-MS級(jí)

梯度條件：見(jiàn)下表

樣品制備

用0.6U的核酸酶P1、0.2U的蛇毒磷酸二酯酶、0.2U的牛腸磷酸酶和10U的Benzonase核酸酶，在5mM Tris （pH8）和1mM氯化鎂溶液中，37℃酶解2小時(shí)，將10μg的RNA酶切至核苷水平。另外，可以選擇性地添加脫氨酶抑制劑，如噴司他?。ㄏ佘彰摪泵敢种苿?，200ng）和四氫尿苷（胞苷脫氨酶抑制劑，500ng），以避免核苷降解。

標(biāo)樣：腺苷或另一種主要核苷（C, U或G）

色譜系統(tǒng)

色譜柱：Synergi Fusion, 4μm, 80?孔徑, 250×2.0mm; Phenomenex

柱溫：35℃

流速：0.35mL/min

檢測(cè)器：UV 254nm

儀器參數(shù)

質(zhì)譜儀：配備電噴霧離子源（ESI）的三重四極桿

模式：正離子模式，dMRM（動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）

ESI參數(shù)：氣體溫度300℃，氣體流量7L/min，霧化器壓力60psi，鞘氣溫度400°C，鞘氣流量12L/min，毛細(xì)管電壓3000v，噴嘴電壓0v

QQQ參數(shù)：取決于必須檢測(cè)的修飾核苷。建議對(duì)每臺(tái)質(zhì)譜儀的儀器參數(shù)（破碎器、碰撞能量、加速器電壓）進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最佳靈敏度

分析——相對(duì)定量

用MS/MS法測(cè)定各修飾核苷的峰面積。

修飾核苷的量用腺苷校正，以消除進(jìn)樣量不同帶來(lái)的差異。為此，從254nm處記錄的紫外色譜中獲取腺苷的峰面積。

通過(guò)在每個(gè)樣品中加入同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行定量。

A(MS mod)=修飾核苷酸的MS峰面積

n(ISTD)=每個(gè)樣品的內(nèi)標(biāo)量

A(MS ISTD)=內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜峰的面積

A(UV腺苷)=腺苷的峰面積

或者，可以選擇另一種主核苷（C、U或G）進(jìn)行校正。例如，在酶促多聚腺苷酸化的情況下，它會(huì)導(dǎo)致未知或不同數(shù)量的腺苷。

分析——絕對(duì)定量

用MS/MS法測(cè)定各修飾核苷的峰面積。

修飾核苷的量用腺苷校正，以消除進(jìn)樣量不同帶來(lái)的差異。為此，從254nm處記錄的紫外色譜中提取腺苷的峰面積。

使用外部校準(zhǔn)溶液進(jìn)行絕對(duì)定量。準(zhǔn)備濃度為0.1、0.5、1、5、10、50、100和500nM的校準(zhǔn)溶液，用于MS/MS檢測(cè)修正，每個(gè)修飾含有等量的內(nèi)標(biāo)。

每種稀釋液注入10μL，在1-5000fmol范圍內(nèi)進(jìn)行校準(zhǔn)。對(duì)于腺苷，準(zhǔn)備濃度為0.1、1、10和100fmol的校準(zhǔn)溶液。每種稀釋液注入5μL，在0.5-500pmol范圍內(nèi)進(jìn)行校準(zhǔn)。響應(yīng)因子對(duì)應(yīng)于校準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性擬合的斜率（峰面積對(duì)應(yīng)于各自的量）。

X(每個(gè)修主核苷的修飾量)=絕對(duì)定量，每個(gè)主核苷修飾量

A(MS mod)=各自修飾的MS峰面積

A(MS ISTD)=內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜峰的面積

n(ISTD)=每個(gè)樣品的內(nèi)標(biāo)量

rf(MS mod/MS ISTD)=各自修飾物與內(nèi)標(biāo)物之比的響應(yīng)因子

A(UV腺苷)=腺苷的紫外峰面積

RF(UV腺苷)=相應(yīng)修飾的響應(yīng)因子

對(duì)于已定義的已知序列的mRNA：

修飾核苷的數(shù)量可以歸一化為RNA分子的數(shù)量。

X(mod/RNA)=絕對(duì)定量，每個(gè)RNA分子的修飾量

N(腺苷)=RNA序列中各自修飾的數(shù)目

或者，可以選擇另一種主核苷（C、U或G）進(jìn)行歸一化。防止在酶促聚腺苷酸化的情況下，導(dǎo)致未知數(shù)量的腺苷。