T細胞作為免疫系統(tǒng)的衛(wèi)士，肩負著適應性免疫的重擔，在細胞免疫和體液免疫都有著關鍵性的作用。不僅如此，基于T細胞的三大免疫療法：CAR-T、TCRT、TILs也在“遍地開花”。截止目前，FDA共批準了6款CAR-T產(chǎn)品，中國也上市了5款CAR-T產(chǎn)品，全球共有11款CAR-T產(chǎn)品獲批！2024年2月16日，全球shou款TIL療法- lifileucel（LN-144）獲批上市，用于治療晚期黑色素瘤，成為有望攻克實體瘤的又一把利劍。
類器官與T細胞的共培養(yǎng)也是一大研究“爆點”：T細胞與腫瘤類器官共培養(yǎng)，可為優(yōu)化個性化實體瘤靶向細胞療法提供支持[1]，也可基于類器官免疫共培養(yǎng)技術的藥物篩選平臺，篩選出能改善腫瘤免疫原性的表觀遺傳調節(jié)藥物[2]。
不可否認的是，這些巨大成就都依賴于T細胞的體外培養(yǎng)，那么T細胞的體外擴增培養(yǎng)又是如何實現(xiàn)的呢？小優(yōu)接下來會從T細胞來源---培養(yǎng)---激活---擴增---分化---活力維持---功能檢測---熱門研究八個方面給大家介紹。
敲黑板：T細胞之外你還想了解哪些細胞？更多驚喜文末等著你~

1.T細胞來源
可來源于捐獻者的血液或者其他實體組織樣本，進而通過樣本制備、細胞分選等操作獲得高純度高活性的T細胞。具體樣本制備和細胞分選的內(nèi)容，小伙伴們可以參考之前的文章：《免疫細胞培養(yǎng)通關技巧之樣本制備》和《免疫細胞培養(yǎng)通關技巧之細胞分選》。用于癌癥治療的原代T細胞通常來自自體（患者）或同種異體（非患者）供體。自體樣本是CAR-T療法等過繼細胞治療的標準做法，有助于避免在輸回患者體內(nèi)時與非自身抗原發(fā)生自身免疫反應。在這些情況下，培養(yǎng)和擴增工程化T細胞至關重要，因為癌癥患者的天然T細胞數(shù)量通常會減少。
文中部分相關產(chǎn)品：

2.T細胞培養(yǎng)
培養(yǎng)體系
可使用經(jīng)典的培養(yǎng)體系，即基礎培養(yǎng)基（實驗室中培養(yǎng)T細胞常用的培養(yǎng)基是RPMI-1640）+胎牛血清或者無血清培養(yǎng)基。需要注意的是，胎牛血清作為動物源制品，若培養(yǎng)的T細胞后續(xù)用于人類治療時則需慎重，小優(yōu)更傾向于推薦大家使用無血清的培養(yǎng)體系。
 

圖1含血清和無血清培養(yǎng)體系的區(qū)別

文中部分相關產(chǎn)品：

培養(yǎng)條件
T細胞的培養(yǎng)溫度為37°C；CO2 濃度通常為5%；此外，也需要防止細菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素、病毒等污染物的出現(xiàn)。這部分的內(nèi)容大家可以參考《免疫細胞培養(yǎng)通關技巧之質量優(yōu)化》。
文中部分相關產(chǎn)品：

3.T細胞激活
自然狀態(tài)下，T細胞的激活需要兩個信號：第一個信號T細胞上的抗原特異性T細胞受體（TCR/CD3）與抗原提呈細胞（APC）上的抗原肽-MHC分子復合物的相互作用，即抗原識別過程，第一信號是T細胞活化所必須的，但不能引起T細胞增殖和細胞因子釋放。當T細胞表面表達的共刺激分子與APC表達的配體相結合時，就生成了第二個T細胞激活信號，其中最重要的是T細胞表面CD28分子與APC表面相應配體B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的結合。而在體外培養(yǎng)T細胞時，則借助CD3和CD28抗體來模擬兩個激活信號。另外，也可以將CD3和CD28抗體偶聯(lián)磁珠或多聚體以激活T細胞，或者使用商品化的激活擴增試劑盒。

圖2 T細胞的體內(nèi)體外激活示意圖

抗體法[3]：在體外聯(lián)合使用抗CD3和CD28的抗體刺激T細胞，抗CD3單克隆抗體識別 TCR-CD3復合體上CD3分子的ε鏈并相互作用，從而增強T淋巴細胞的活化與增殖?？笴D28單克隆抗體與B7-CD28復合體上的CD28分子相互作用，能提供有效的共刺激信號，激發(fā)T細胞增殖，可誘導T細胞的分化、增殖和IL-2等細胞因子的分泌。從而模擬T細胞活化的雙信號作用。
a)  使用anti-human CD3抗體（無菌PBS稀釋）包被24孔板，包被濃度1μg/mL；室溫放置4 h（也可4℃包被過夜），吸去未結合的抗體懸液；
b)  每孔加入500 μL含1%BSA的PBS溶液進行封閉，室溫30 min，結束后用無菌PBS洗滌1次；
c)  PBMC接種于上述24孔板中，接種密度1*106/mL，培養(yǎng)體系為含10%熱滅活胎牛血清、1%雙抗、3μg/mL anti-human CD28、100 IU/mL human IL-2的RPMI-1640培養(yǎng)基；
d)  培養(yǎng)3天后，收集細胞，計數(shù)，臺盼藍染色檢測細胞活力，用于進一步分析。

磁珠法：以美天旎T Cell TransAct™, huma為例：在100nm右旋糖苷基質上分別耦聯(lián)人源化的CD3、CD28抗體，高效模擬抗原遞呈過程，實現(xiàn)高效、持久的T細胞激活。使用時，按照體積比1:100加入即可。
 

圖3 不同孔板對應的T細胞密度及所需激活試劑體積

注意事項：
原代T細胞一般在體外的培養(yǎng)時間不超過三周，用于功能實驗的T細胞建議培養(yǎng)時間在14天以內(nèi)。
抗體法中CD3和CD28的包被濃度需要摸索確定，一般為1-10ug/ml，且多采用CD3包被，CD28游離的方法。
磁珠法中，磁珠分為微米級和納米級，以T Cell TransAct™, human（130-128-758，納米級）和T Cell Activation/Expansion Kit, human（130-091-441，微米級）為例， 130-128-758（微米級）是通過換液，或者離心清洗就可以去除，130-091-441（微米級）則通過MACSiMAG分選器去除磁珠和抗體。
文中部分相關產(chǎn)品：

4.T細胞擴增
T細胞擴增使研究人員能夠生成大量T細胞，以最大限度地發(fā)揮治療潛力。通常會在培養(yǎng)物中添加特定細胞因子，例如白細胞介素2 (IL-2) 或 IL-7/IL-15，以支持T細胞擴增和存活。21年一篇文獻發(fā)現(xiàn)：T細胞密度為2.5×105 cell/mL時的擴增效果優(yōu)于較高或較低密度，且在高于50 IU/mL的IL-2濃度下表現(xiàn)出更高的擴增效率[4]。當需要大量抗原特異性T細胞時，可以反復接觸抗原以激活T細胞從而達到擴增的目的，但是反復激活的方法應謹慎使用，因為它會導致T細胞衰竭和功能下降。在擴增階段，可以觀察T細胞克隆團的形成、檢測細胞增殖情況或者流式細胞術檢測相應的細胞標記物。
 

圖4 T細胞擴增階段形成的克隆團[5]

5.T細胞分化
不同類型的效應T細胞在免疫調節(jié)網(wǎng)絡中發(fā)揮著核心作用，該網(wǎng)絡充當人體的防線，并在疾病狀態(tài)下引發(fā)免疫反應。如Th1細胞因子在識別和清除細胞內(nèi)病原體如病毒和細菌，包括結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌和利什曼原蟲方面起著重要作用；Th2細胞介導針對細胞外寄生蟲、細菌、過敏原和毒素免疫反應的活化和維持；Th17細胞在宿主防御細胞外病原體中發(fā)揮作用；Treg對維持自身耐受性和免疫細胞穩(wěn)態(tài)至關重要。T細胞體外誘導分化需要添加的細胞因子或抗體大家可以參考圖5，同時小優(yōu)也給大家匯總了一份體外誘導T細胞分化方案（圖6）。

圖5 Na?ve T細胞在不同抗體或細胞因子作用下誘導分化為對應亞型

 圖6 體外誘導T細胞分化方案[6]

文中部分相關產(chǎn)品：

6.T細胞活力維持
T細胞活力對于任何T細胞培養(yǎng)實驗或治療的成功都至關重要，在這里需要確認三個方面的因素：避免T細胞培養(yǎng)密度過高而出現(xiàn)密度抑制的現(xiàn)象；確保培養(yǎng)體系可以提供T細胞必需的營養(yǎng)物質和生長因子；保證培養(yǎng)環(huán)境的無菌。

7.T細胞功能檢測
一旦培養(yǎng)出足夠數(shù)量的T細胞，就可以通過各種實驗方法來評估T細胞的表型、功能和活力，比如：
細胞毒性試驗：測量T細胞殺死靶細胞（例如癌細胞或感染細胞）的能力。
ELISpot檢測：酶聯(lián)免疫吸附斑點（ELISpot)實驗可量化特定細胞因子的分泌，從而了解T細胞的功能。
流式細胞術：可用于分析T細胞的表面標志物、胞內(nèi)蛋白及信號轉導。
 

圖7 T細胞不同亞型的表面標記物、轉錄因子以及分泌的細胞因子

文中部分相關產(chǎn)品：

8.T細胞熱門研究
小優(yōu)以發(fā)表在Nature Protocols的《Tumor organoid–T-cell coculture systems》中描述的腫瘤類器官與T細胞共培養(yǎng)為例給大家介紹：
類器官part：在開始共培養(yǎng)之前，需從腫瘤組織中獲取腫瘤細胞建立腫瘤類器官，在共培養(yǎng)前兩天從基質膠中分離腫瘤類器官，共培養(yǎng)前一天用IFN-γ進行刺激，共培養(yǎng)當天，將腫瘤類器官解離成單細胞。
T細胞part：從外周血中分離PBMC，具體的操作方法也可以參考《免疫細胞培養(yǎng)通關技巧之樣本制備》。
共培養(yǎng)part： 將腫瘤類器官單細胞懸液與PBMC一起培養(yǎng)在涂有anti-CD28的培養(yǎng)皿中，并加入IL2和anti-PD1。共培養(yǎng)一周后，將新的腫瘤類器官解離成單細胞懸液再次刺激PBMC。共培養(yǎng)兩周后，可凍存T細胞（黃色）、評估T細胞對腫瘤細胞的反應性（綠色）或進行腫瘤類器官殺傷實驗（藍色）。
 

圖8 腫瘤類器官- T細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)流程圖[7]

文中部分相關產(chǎn)品：

注意事項：
共培養(yǎng)前使用IFN-γ刺激腫瘤類器官的目的是使后續(xù)共培養(yǎng)時抗原呈遞zui大化
共培養(yǎng)時加入anti-PD1是為了抵消IFN-γ對PD-L1的誘導
腫瘤類器官與免疫細胞共培養(yǎng)時，需要精確控制免疫細胞比例及激活狀態(tài)
免疫系統(tǒng)對腫瘤的反應是動態(tài)變化的，包括免疫監(jiān)視、免疫逃逸和腫瘤免疫編輯等過程，這些都需要在模型中得到有效模擬

優(yōu)寧維重磅開啟細胞培養(yǎng)的科學之旅-細胞大師訓練營項目！旨在為廣大科研用戶提供有深度有價值的細胞培養(yǎng)攻略和全面的細胞培養(yǎng)產(chǎn)品。
 

24年6月-12月的主題細胞整裝待發(fā)，未來也會有更多的主題細胞和大家見面，每月一場，通關即可成為“細胞大師”！（點擊圖片獲取更多精彩內(nèi)容）
講座結束后次月，優(yōu)寧維會推出xx細胞培養(yǎng)protocol，現(xiàn)成的實驗方案+所需試劑，讓您的細胞培養(yǎng)不再難！第一站：免疫衛(wèi)士-T細胞（6月18-7月5日）正在火熱進行中，更多干貨等你來！ 

細胞大師學習搭子
活動期間，優(yōu)寧維將為邀請好友top5（超過5人參與排名）的“細胞大師”送上精美禮品和榮譽獎狀，當月活動結束后會在優(yōu)寧維抗體專家公眾號和優(yōu)寧維M小助手朋友圈公布。

精選：細胞大師bi備神器
有用的知識增加了，那羊毛怎么可以錯過？活動期間，可領取滿減優(yōu)惠券，用于購買相關產(chǎn)品。恰逢618，還有夏日尋寶狂歡節(jié)：HyClone血清買送PBS，更有驚喜團購價；美天旎T細胞相關現(xiàn)貨磁珠買1送“2”；愛必信現(xiàn)貨5件8折，10件7折。

T細胞之外你還想了解哪些細胞？
除了免疫衛(wèi)士-T細胞，人體還有許多細胞在“賣力工作”（圖5）。人體有四大組織：神經(jīng)組織、結締組織、上皮組織、肌肉組織。每種細胞都有其存在的價值和研究的意義：神經(jīng)元活動與情緒調節(jié)和心理健康緊密相關，研究神經(jīng)元有助于理解抑郁癥、焦慮癥等心理疾病的成因；成纖維細胞與腫瘤細胞之間的相互作用影響腫瘤的生長和轉移，了解這些相互作用有助于開發(fā)抗癌策略；巨噬細胞作為固有免疫的關鍵細胞，可參與炎癥、腫瘤免疫、自身免疫疾病等多種生理病理過程。

圖5 人體四大組織及對應細胞類型

1.  Dekkers, J.F., et al., Uncovering the mode of action of engineered T cells in patient cancer organoids. Nature Biotechnology, 2022. 41(1): p. 60-69.
2.  Zhou, Z., et al., A T Cell‐Engaging Tumor Organoid Platform for Pancreatic Cancer Immunotherapy. Advanced Science, 2023. 10(23).
3.  Soltantoye, T., et al., Soluble and Immobilized Anti-CD3/28 Distinctively Expand and Differentiate Primary Human T Cells: An Implication for Adoptive T Cell Therapy. Iranian Journal of Allergy, Asthma and Immunology, 2022.
4.  Ghaffari, S., et al., Optimizing interleukin-2 concentration, seeding density and bead-to-cell ratio of T-cell expansion for adoptive immunotherapy. BMC Immunology, 2021. 22(1).
5.  Zhang, D.K.Y., A.S. Cheung, and D.J. Mooney, Activation and expansion of human T cells using artificial antigen-presenting cell scaffolds. Nature Protocols, 2020. 15(3): p. 773-798.
6.  Sekiya, T. and A. Yoshimura, In Vitro Th Differentiation Protocol, in TGF-β Signaling. 2016. p. 183-191.
7.  Cattaneo, C.M., et al., Tumor organoid–T-cell coculture systems. Nature Protocols, 2019. 15(1): p. 15-39.
  

上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司

試劑 | 耗材 | 儀器 | 軟件 | 定制 | 實驗服務 | 供應鏈

微信公眾平臺：優(yōu)寧維抗體專家，歡迎關注！