細(xì)胞通過機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程感知和響應(yīng)細(xì)胞外機(jī)械環(huán)境，包括靜態(tài)和動(dòng)態(tài)。在這個(gè)過程中，來自靜態(tài)細(xì)胞外機(jī)械環(huán)境（例如，基質(zhì)剛度、形貌、微圖案細(xì)胞大小提供的機(jī)械力條件等）和動(dòng)態(tài)外部機(jī)械負(fù)荷線索（例如，機(jī)械拉伸、流體剪切、壓縮等）的信號(hào)被轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)。這最終會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成和下游分子信號(hào)的變化。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種特殊的祖細(xì)胞群，可以分化成多種細(xì)胞類型，包括骨骼、軟骨、肌肉和脂肪細(xì)胞以及其他細(xì)胞類型。特別是，骨髓環(huán)境中 MSC 成骨與成脂性能和分化的平衡對(duì)于健康的骨穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。目前，已經(jīng)研究了生化線索影響 MSC 譜系成骨或成脂 的能力。例如，暴露于不同類型的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）導(dǎo)致 MSC 成骨或脂肪生成。還已經(jīng)確定，機(jī)械物理線索，如機(jī)械拉伸負(fù)荷，可以介導(dǎo) MSC 成骨或脂肪生成。然而，對(duì)于生化和機(jī)械物理線索，MSC 命運(yùn)決定成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞的潛在分子機(jī)制尚未揭示。

最近，專注于 MSC 成骨的研究表明，YES相關(guān)蛋白（YAP）和具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（TAZ）在 MSCs 的成骨轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)中起著核心作用。值得注意的是，絕大多數(shù)關(guān)于 YAP 對(duì) MSC 成骨的機(jī)械物理控制的研究都涉及靜態(tài)的細(xì)胞外機(jī)械物理線索—如上所述的基質(zhì)剛度和細(xì)胞微圖案大小。相比之下，關(guān)于 YAP 機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì) MSC 成骨轉(zhuǎn)錄的動(dòng)態(tài)機(jī)械負(fù)荷控制知之甚少。

鑒于此，美國(guó)內(nèi)布拉斯加大學(xué)林肯分校機(jī)械與材料工程系及弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的研究團(tuán)隊(duì)曾報(bào)告了 MSC 在 YAP 激活和由此產(chǎn)生的成骨轉(zhuǎn)錄和終末分化中對(duì)循環(huán)機(jī)械拉伸負(fù)荷的響應(yīng)。這是第一項(xiàng)報(bào)告 MSCs 中 Hippo 和 YAP 機(jī)械信號(hào)的機(jī)械拉伸負(fù)荷控制以及 ROCK 和 F-肌動(dòng)蛋白在通過 YAP 介導(dǎo) MSC 成骨過程中的調(diào)節(jié)作用的研究。研究成果發(fā)表在 Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 期刊題為“YAP mechanotransduction under cyclic mechanical stretch loading for mesenchymal stem cell osteogenesis is regulated by ROCK”。

首先，在循環(huán)機(jī)械拉伸下測(cè)試 MSCs 中 YAP 機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)之前，研究人員確認(rèn)了拉伸誘導(dǎo)的 MSC 成骨分化。然后研究了拉伸誘導(dǎo)的 YAP 核轉(zhuǎn)運(yùn)。雖然在未拉伸的 MSCs 中整個(gè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都可以看到 YAP 的亞細(xì)胞定位，但循環(huán)拉伸觸發(fā)了 YAP 向細(xì)胞核的易位（圖1 A）。通過免疫細(xì)胞化學(xué)和 NIH ImageJ 量化 YAP 核定位陽性細(xì)胞的百分比（圖1 B），觀察到在 10% 應(yīng)變和 1 Hz 頻率下，MSCs中的 YAP 核定位在 1 h 循環(huán)拉伸時(shí)最多，因此在隨后的測(cè)試中使用了這套方案。進(jìn)一步評(píng)估拉伸后的 YAP 核轉(zhuǎn)運(yùn)（圖1 C、D），發(fā)現(xiàn)循環(huán)拉伸顯著增加細(xì)胞核內(nèi)的 YAP 蛋白水平，同時(shí)降低細(xì)胞質(zhì) YAP 表達(dá)。這意味著 MSCs 中 YAP 動(dòng)態(tài)機(jī)械傳感響應(yīng)外部機(jī)械拉伸負(fù)荷的潛在趨勢(shì)。

圖1    循環(huán)拉伸負(fù)荷誘導(dǎo)MSCs中YAP核轉(zhuǎn)位。

Hippo 信號(hào)是 YAP 的潛在上游通路。如果 Hippo 信號(hào)通過大腫瘤抑制激酶（LATS）的磷酸化上調(diào)，那 YAP 也可能被磷酸化，從而導(dǎo)致 YAP 細(xì)胞質(zhì)滯留和降解。相反，去磷酸化的 YAP 能夠轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核進(jìn)行激活。為了測(cè)試機(jī)械拉伸對(duì)這些機(jī)制的影響，接下來，研究人員對(duì) MSCs 進(jìn)行拉伸并評(píng)估YAP的磷酸化。當(dāng)循環(huán)拉伸時(shí)，MSCs 在 S127 和 S397 位點(diǎn)的內(nèi)源性 YAP 磷酸化顯著降低。此外，LATS1（p-LATS1）的磷酸化被  30 min 的循環(huán)拉伸顯著抑制，從而暗示 LATS 等 Hippo 通路可能參與 YAP 的拉伸調(diào)控。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸負(fù)荷通過下調(diào) YAP 磷酸化及其細(xì)胞質(zhì)滯留來促進(jìn) MSCs 中的 YAP 核轉(zhuǎn)運(yùn)，并且抗-YAP Hippo 通路—p-LATS 的拉伸調(diào)控可能發(fā)揮相關(guān)作用。

基于上述發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)又通過用 YAP siRNA 轉(zhuǎn)染 MSCs 來檢測(cè) YAP 在拉伸誘導(dǎo)的 MSC 成骨中的作用。據(jù)觀察，在YAP siRNA 存在下，循環(huán)拉伸對(duì)關(guān)鍵成骨轉(zhuǎn)錄因子 RUNX2 蛋白表達(dá)的刺激作用被消除（圖2 A、B）。通過 qRT-PCR 評(píng)估，沉默YAP 消除了拉伸誘導(dǎo)的成骨轉(zhuǎn)錄因子和基因標(biāo)記物 RUNX2、ALP、COL-I 和 OPN 的增加（圖2 C）。與這些數(shù)據(jù)一致，拉伸后 MSCs 顯示出增強(qiáng)的骨樣礦化，而這種效應(yīng)被 YAP siRNA 破壞（圖2 D、E）。這些結(jié)果表明，敲低 YAP 抑制循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的 MSC 成骨，循環(huán)拉伸對(duì) MSC 成骨轉(zhuǎn)錄和分化的促進(jìn)依賴于 YAP 的功能作用。

圖2    沉默YAP會(huì)損害循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的MSC成骨轉(zhuǎn)錄和分化。

研究表明，YAP 活性與 F-actin 的形成呈正相關(guān)。此外，機(jī)械拉伸負(fù)荷可以促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑以組裝 F-actin?？紤]到 Rho / ROCK 是 F-actin 形成的上游信號(hào)調(diào)節(jié)因子，因此，實(shí)驗(yàn)測(cè)試了 Rho / ROCK 是否參與調(diào)節(jié)機(jī)械拉伸下 MSCs 中的 YAP 核轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng) MSCs 在 Y27632（一種ROCK抑制劑）存在下暴露于循環(huán)拉伸時(shí)，拉伸誘導(dǎo)的 YAP 核轉(zhuǎn)運(yùn)被顯著抑制（圖3 A、B）。與此一致，Y27632 顯著降低了循環(huán)拉伸引起的細(xì)胞核 YAP 滯留的增加（圖3 C、D）。

最后，研究人員驗(yàn)證了 ROCK 在拉伸下對(duì) F-actin 的控制。肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的形成在暴露于循環(huán)拉伸的 MSCs 中明顯增強(qiáng)，而這種增強(qiáng)受到 Y27632 的破壞。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸負(fù)荷通過 ROCK 誘導(dǎo) F-actin 的形成，這有助于 YAP 在拉伸負(fù)荷下的核轉(zhuǎn)運(yùn)。

基于以上表明 ROCK 是 MSCs 中拉伸誘導(dǎo)的 YAP 核轉(zhuǎn)運(yùn)所必需的，因此實(shí)驗(yàn)還研究了抑制 ROCK 對(duì)拉伸下 MSC 成骨的影響。結(jié)果表明，當(dāng)在 Y27632 下施加循環(huán)拉伸時(shí)，拉伸誘導(dǎo)的 MSC 成骨轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)以及礦化的增加顯著降低。這表明，ROCK 抑制劑 Y27632 抑制循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的 MSC 成骨。

圖3     ROCK抑制劑消除了循環(huán)拉伸負(fù)荷誘導(dǎo)的YAP核轉(zhuǎn)運(yùn)。

綜上所述，該研究考察了循環(huán)機(jī)械拉伸負(fù)荷下 MSCs 中的 YAP 機(jī)械傳感及其對(duì) MSC 成骨轉(zhuǎn)錄和分化的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在 10% 應(yīng)變和 1 Hz 頻率下的循環(huán)拉伸觸發(fā)了 MSCs 中的 YAP 核轉(zhuǎn)運(yùn)。這種拉伸誘導(dǎo)的 YAP 核轉(zhuǎn)運(yùn)是通過降低 S127 和 S397 位點(diǎn)的 YAP 磷酸化來實(shí)現(xiàn)的。此外，抗-YAP-調(diào)控的 Hippo 通路，LATS1磷酸化，被循環(huán)拉伸抑制。由于 YAP siRNA 損害了拉伸誘導(dǎo)的 MSC 成骨特性，因此循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的 MSC 成骨轉(zhuǎn)錄和分化是由 YAP 核轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)的。實(shí)驗(yàn)還表明，響應(yīng)循環(huán)拉伸的 YAP 核轉(zhuǎn)運(yùn)被 ROCK 抑制劑消除，這表明 ROCK 和相關(guān)的下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)（如 F-肌動(dòng)蛋白）參與了 YAP 的動(dòng)態(tài)機(jī)械負(fù)荷激活。因此，通過抑制 ROCK 可抑制拉伸誘導(dǎo)的 MSC 成骨。該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可能為利用間充質(zhì)干細(xì)胞的骨組織工程和骨骼再生醫(yī)學(xué)提供啟示。具體而言，間充質(zhì)干細(xì)胞中 YAP 介導(dǎo)的成骨轉(zhuǎn)錄的動(dòng)態(tài)機(jī)械負(fù)荷控制可能為潛在的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和所需的機(jī)械負(fù)荷工具提供見解。

參考文獻(xiàn)：Kim E, Riehl BD, Bouzid T, Yang R, Duan B, Donahue HJ, Lim JY. YAP mechanotransduction under cyclic mechanical stretch loading for mesenchymal stem cell osteogenesis is regulated by ROCK. Front Bioeng Biotechnol. 2024 Jan 11;11:1306002. doi: 10.3389/fbioe.2023.1306002. PMID: 38274006; PMCID: PMC10809151.

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