血管生成，涉及從預(yù)先存在的毛細(xì)血管中萌發(fā)新的血管，有助于胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和傷口愈合。血管生成或血管修復(fù)的調(diào)控缺失是動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重并發(fā)癥。此外，血管生成異常限制了缺血性疾病的組織恢復(fù)。因此，血管生成在心血管疾病中具有巨大的血管再生潛力。

細(xì)胞行為和命運(yùn)由機(jī)械微環(huán)境決定。內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的特定機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制參與調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)，從而塑造血管系統(tǒng)以優(yōu)化流向組織的血流。研究發(fā)現(xiàn)，剪切應(yīng)力有效調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs），在促進(jìn)血管生成方面具有巨大潛力。還有報(bào)告稱，增加的剪切應(yīng)力通過靜脈叢中的 BMP-依賴性途徑抑制血管生成。因此，剪切應(yīng)力因其在血管再生中的潛在作用而得到認(rèn)可。然而，不同的血流模式（層流和擾動(dòng)流）如何決定血管生成在很大程度上仍不清楚。

遷移和侵襲增強(qiáng)子1（MIEN1）是一種在腫瘤組織中廣泛表達(dá)的新基因，對(duì)細(xì)胞的侵襲和遷移具有重要的控制作用。此外，MIEN1 維持肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的可塑性以增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性。EC 的遷移對(duì)血管生成至關(guān)重要，血管生成受機(jī)械刺激的定向調(diào)控。EC 對(duì)剪切應(yīng)力的響應(yīng)涉及重塑肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的多種信號(hào)通路的激活，從而促進(jìn) EC 的遷移。在血管生成萌芽期間控制 EC 行為的各種信號(hào)通路中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)在調(diào)節(jié)血管生成中起著至關(guān)重要的作用。最近，MAPK 信號(hào)被證明與血管重塑和發(fā)芽有關(guān)。

最近，在四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究室課題人員的一項(xiàng)工作中，初步研究了不同血流模式（生理LSS：15 dyn/cm2；促動(dòng)脈粥樣硬化血流DSS：0.5 ± 4 dyn/cm2）對(duì)體外血管生成的影響，探討了不同血流模式下內(nèi)皮血管生成的變化及其潛在機(jī)制。研究結(jié)果顯示，通過 MIEN1-ERK/MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸，擾動(dòng)流顯著損害了 ECs 的血管生成。這些結(jié)果為擾動(dòng)剪切應(yīng)力對(duì)血管生成的影響提供了直接的見解。詳細(xì)研究成果發(fā)表在 The Journal of Cellular Physiology 期刊題為“Hemodynamic force dictates endothelial angiogenesis through MIEN1-ERK/MAPK-signaling axis”。

首先，研究了響應(yīng)不同 FSS 模式的血管樣結(jié)構(gòu)的形成，發(fā)現(xiàn)與擾動(dòng)流相比，層流中形成的 HUVECs 的血管樣結(jié)構(gòu)更多。VEGF 被認(rèn)為是血管生成的重要介質(zhì)，能夠刺激血管生成萌芽，包括 VEGFA，VEGFB，VEGFC 和 VEGFD 多種亞型，因此，檢測(cè)了四種亞型的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果表明，與 LSS 相比，DSS 中 VEGFB mRNA 水平下調(diào)，而 VEGFA、C 和 D 的 mRNA 表達(dá)顯著增加。蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示，與 LSS 相比，DSS 中 VEGFB 的表達(dá)較低，而兩組之間的 VEGFA、C 和 D 表達(dá)無顯著差異。免疫熒光分析證實(shí)，與 LSS 相比，DSS 下 HUVECs 的細(xì)胞質(zhì)和膜區(qū)域中的 VEGFB 分布顯著降低（圖1 f、g）。

進(jìn)一步探究 VEFGB 對(duì) FSS 的影響，用 10 ng/mL VEGFB 誘導(dǎo)后，可以發(fā)現(xiàn) ECs 在擾動(dòng)流條件下傾向于形成血管樣結(jié)構(gòu)（圖1 h）。定量分析證實(shí)，誘導(dǎo)擾動(dòng)組的血管小管和腎小管面積相對(duì)對(duì)照組增加（圖1 i）。相反，靜態(tài)組和層流組在有或沒有 VEGFB 處理的情況下沒有差異。這些結(jié)果表明，DSS 通過降低 HUVECs 中 VEGFB 的表達(dá)來破壞血管生成過程。

圖1    Matrigel上 HUVECs 的血管生成響應(yīng)不同模式的 FSS。

接下來，為了探究剪切應(yīng)力誘導(dǎo)血管生成的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)關(guān)注了不同流動(dòng)模式條件下細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HUVECs 中響應(yīng) DSS 的基因數(shù)量減少，特別是 MIEN1 在 DSS 中的 mRNA 和蛋白水平均顯著降低。通過免疫熒光探索 HUVECs 中 MIEN1 的分布（圖2 e、f），觀察到 LSS 組中大量 MIEN1 高表達(dá)。此外，MIEN1 在 HUVECs 中呈點(diǎn)狀分布，主要分散在 LSS 組的細(xì)胞質(zhì)和膜區(qū)域。

為了研究 MIEN1 在剪切應(yīng)力介導(dǎo)的血管生成中的作用，用 MIEN1 siRNA 轉(zhuǎn)染 HUVECs 降低 MIEN1 蛋白的表達(dá)（圖2 a、b、c）。上述結(jié)果表明，DSS 導(dǎo)致 HUVECs 中 VEGFB 的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)降低。因此，接下來確定 MIEN1 是否是 VEGFB 表達(dá)所必需的。數(shù)據(jù)證實(shí)，si-MIEN1 減弱了 VEGFB 的表達(dá)，進(jìn)一步突出了 MIEN1 在此過程中的重要性（圖2 b、d）。同時(shí)，進(jìn)行 MIEN1 的過表達(dá)也證實(shí)了上述結(jié)果，顯示 MIEN1 的上調(diào)顯著增強(qiáng)了 VEGFB 的表達(dá)。

研究證實(shí)，暴露于 LSS 的 ECs 表現(xiàn)出比 DSS 更高的 F-肌動(dòng)蛋白表達(dá)水平。因此，研究了不同流動(dòng)條件下 HUVECs 中微絲的分布。暴露于層流中，HUVECs 顯示出明顯且明確的絲狀 F-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)，然而在擾動(dòng)流下，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白出現(xiàn)分散。隨后使用 si-MIEN1 敲低 MIEN1，發(fā)現(xiàn) LSS 和 DSS 組內(nèi)細(xì)胞骨架組織都受到干擾（圖2 e）。此外，MIEN1 的降低擾亂了細(xì)胞骨架在微絲（F-肌動(dòng)蛋白束）形成中的組織（圖2 g）。定量分析顯示，與 LSS 組相比，DSS 組中 F-肌動(dòng)蛋白的熒光強(qiáng)度降低（圖2 f）。一般來說，DSS 破壞了細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)完整性。然而，MIEN1 過表達(dá)組在 DSS 條件下表現(xiàn)出增強(qiáng)的細(xì)胞骨架組織能力。

隨后，探討了 MIEN1 在血管生成中的作用。在 LSS 組中，用 si-MIEN1 轉(zhuǎn)染明顯抑制了血管樣結(jié)構(gòu)的形成（圖2 h）。在層流條件下，血管連接處和腎小管面積均降低（圖2 i）。有趣的是，與 DSS 相比，MIEN1 的過表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞中血管樣結(jié)構(gòu)的形成。這些結(jié)果表明，DSS 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架排列和降低 MIEN1 來損害內(nèi)皮血管生成。

圖 2    MIEN1是剪切應(yīng)力調(diào)節(jié)血管生成所必需的。

實(shí)驗(yàn)探索了響應(yīng) LSS 和 DSS 的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)通路的改變，通過熱圖對(duì)響應(yīng)不同剪切應(yīng)力的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因進(jìn)行聚類，發(fā)現(xiàn)與 LSS 相比，DSS 誘導(dǎo)的 HUVECs 中 MAPK 信號(hào)的降低最為顯著，且 p-ERK、p-MEK 和 p-p38 的表達(dá)顯著降低。然后，使用選擇性 ERK 抑制劑 SCH772984 研究了 ERK/MAPK 信號(hào)在 HUVECs 血管生成中的參與。結(jié)果表明，SCH772984 有效地降低了 p-ERK 的表達(dá)。在靜態(tài)和流動(dòng)條件下，SCH772984 處理使血管生成能力明顯減弱。這些發(fā)現(xiàn)表明，剪切應(yīng)力介導(dǎo)的 ERK/MAPK 信號(hào)積極參與血管生成，DSS 通過下調(diào) ERK/MAPK 信號(hào)阻礙內(nèi)皮血管生成。

此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) p-ERK 在細(xì)胞中廣泛分布，特別是在 HUVECs 的細(xì)胞核中。有趣的是，與靜態(tài)組和 DSS 組相比，LSS 組表現(xiàn)出更高的 p-ERK 核分布（圖3 a）。熒光定量顯示，LSS 組中 p-ERK 的核積累增加，DSS 組中的核積累減少（圖3 b）。與靜態(tài)條件相比，LSS 下 HUVECs 中 p-ERK 的總水平顯著增加 193.2%，然而，當(dāng)將 DSS 組與 LSS 組進(jìn)行比較時(shí)，這一水平下降到 55.5%（圖3 c）。研究人員發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SS 通過細(xì)胞膜上的 MIEN1 誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)。si-MIEN1 可有效抑制 p-ERK 表達(dá)（圖3 d、e），而在 si-MIEN1 HUVECs 中ERK 沒有變化（圖3 d、f）。免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)，敲低 MIEN1 可降低 HUVECs 中的 p-ERK 表達(dá)（圖3 g、h）。這些結(jié)果表明，MIEN1 觸發(fā)內(nèi)皮血管生成中的ERK/MAPK信號(hào)。

圖3    MIEN1在內(nèi)皮血管生成中觸發(fā)ERK/MAPK信號(hào)。

圖4     示意圖闡明了DSS通過抑制MIEN1-ERK/MAPK信號(hào)軸損害HUVECs的血管生成。直動(dòng)脈暴露于層流（LSS），而在分支或彎曲血管中，血流受到干擾（DSS）。血液流動(dòng)中的ECs經(jīng)歷機(jī)械感應(yīng)和細(xì)胞質(zhì)信號(hào)變化（ERK/MAPK信號(hào)），改變VEGFB表達(dá)，從而影響血管生成。DSS 相對(duì)于 LSS 會(huì)破壞血管生成。

總之，在這項(xiàng)工作中，研究人員提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，證明血管生成受到不同剪切應(yīng)力模式的顯著影響。血流流動(dòng)中的 ECs 通過 MIEN1 和細(xì)胞骨架重塑進(jìn)行機(jī)械傳感，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)信號(hào)激活（ERK/MAPK信號(hào)），從而改變 VEGFB 的表達(dá)，調(diào)節(jié)血管生成。這些發(fā)現(xiàn)為響應(yīng)剪切應(yīng)力的血管生成的細(xì)胞生物物理變化提供了寶貴的見解。

參考文獻(xiàn)：Cheng L, Shi H, Du L, Liu Q, Yue H, Zhang H, Liu X, Xie J, Shen Y. Hemodynamic force dictates endothelial angiogenesis through MIEN1-ERK/MAPK-signaling axis. J Cell Physiol. 2024 Jan 12. doi: 10.1002/jcp.31177. Epub ahead of print. PMID: 38214132.

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