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用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色劑對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色 LumiTracker ER

來源:上海牧榮生物科技有限公司   2024年03月14日 16:41  

LumiTracker ER Green 和 LumiTracker ER Red 具有細(xì)胞滲透性,對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 染色劑具有高度選擇性,可用于活細(xì)胞成像。兩種 ER 染色劑都是 BDP 染料與格列本脲(格列本脲)偶聯(lián)的衍生物。格列本脲與 ATP 敏感鉀通道 (K ATP ) 的磺酰脲 (SUR) 受體結(jié)合,該受體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上很突出。

用甲醛固定后,染色部分保留。 LumiTracker ER Green 和 LumiTracker ER Red 不適合對(duì)固定后的細(xì)胞進(jìn)行染色。

注意:格列本脲的藥理活性可能會(huì)影響 ER 功能。某些特殊細(xì)胞類型中磺脲類受體的可變表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致非 ER 標(biāo)記。

溶液的制備

1.1 庫存溶液的制備

  • 將 50 μg LumiTracker ER Green 溶解在 64 μL DMSO 中,以獲得 1 mM 儲(chǔ)備溶液。

  • 將 50 μg LumiTracker ER Red 溶解在 55 μL DMSO 中,以獲得 1 mM 儲(chǔ)備溶液。

注意:我們建議將儲(chǔ)備溶液儲(chǔ)存在?20°C或?80°C避光條件下。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

1.2 工作液的配制

用鈣和鎂 (HBSS/Ca/Mg) 在 Hank's 平衡鹽溶液中稀釋 LumiTracker ER 染色劑的儲(chǔ)備溶液,以獲得工作溶液。使用 100 nM 至 1 μM 的濃度。 LumiTracker ER 染色劑的稀釋度取決于細(xì)胞類型和密度,應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)確定。

細(xì)胞染色

2.1 懸浮細(xì)胞染色

  1. 1000 g離心細(xì)胞懸液 3-5 分鐘;棄去上清液。

  2. 用預(yù)熱的 HBSS 在 37°C 下清洗細(xì)胞兩次,每次 5 分鐘。

  3. 推薦的細(xì)胞密度為1×10 6 個(gè)細(xì)胞/mL。

  4. 將 1 mL 預(yù)熱的 LumiTracker ER 工作溶液添加到管中,并在 37 °C 和 5% CO 2下孵育細(xì)胞 15-30 分鐘

  5. 室溫下以 400 g離心細(xì)胞 3-4 分鐘;棄去上清液。

  6. 用培養(yǎng)基清洗染色細(xì)胞兩次。

  7. 用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 重懸細(xì)胞。

  8. 通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。

  9. 對(duì)于熒光顯微鏡,將一滴染色的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到載玻片上。用蓋玻片蓋住細(xì)胞。

2.2 貼壁細(xì)胞染色

  1. 在無菌蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞。

  2. 貼壁細(xì)胞可以直接在蓋玻片上染色。

  3. 從蓋玻片中吸出介質(zhì)。

  4. 用 37°C 預(yù)熱的 HBSS 沖洗細(xì)胞。

  5. 加入 100 μL 預(yù)熱的 LumiTracker ER 工作溶液,輕輕搖動(dòng)以全覆蓋細(xì)胞。在 37 °C 和 5% CO 2下孵育細(xì)胞 15-30 分鐘。

  6. 用培養(yǎng)基清洗染色細(xì)胞兩次。

  7. 如果通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),則需要在染色前重懸細(xì)胞。

  8. 對(duì)于熒光顯微鏡,將帶有染色細(xì)胞的蓋玻片翻轉(zhuǎn)到載玻片上,將它們放置在載玻片和蓋玻片之間。

細(xì)胞固定

  1. 如果要固定染色的細(xì)胞,請(qǐng)?jiān)?4% 甲醛中于 4 °C 下孵育 2 分鐘。

  2. 固定細(xì)胞用 PBS 清洗兩次,每次 5 分鐘。

  3. 使用封固劑將細(xì)胞封固在蓋玻片下 。



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