在實(shí)驗(yàn)開始前，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求對(duì)小室的上下表面進(jìn)行包被。在上室中接種細(xì)胞并加入處理因素，在下室中加入趨化因子。將上下室組合后放入Incucyte® 系統(tǒng)中，并對(duì)小室的上下表面進(jìn)行連續(xù)成像。如上室接種的是懸浮細(xì)胞，其穿過(guò)8μm的半透膜直接進(jìn)入下室，則上室檢測(cè)到的細(xì)胞會(huì)逐漸減少。如上室接種的是貼壁細(xì)胞，其穿過(guò)半透膜后會(huì)黏附在小室的下表面，則下表面檢測(cè)到的細(xì)胞隨時(shí)間會(huì)增加。

CCR1是一種G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DCs、破骨細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。CCR1能與MIP-1α,RANTES 和leukotactin-1等趨化因子結(jié)合后誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的活化和遷移，因此BMS將其作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的靶點(diǎn)，通過(guò)MIP-1α誘導(dǎo)的THP-1趨化實(shí)驗(yàn)篩選CCR1的抑制劑。

圖3A展示了不同濃度的MIP-1α加入下室作用16h后誘導(dǎo)遷移的THP-1細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果呈現(xiàn)倒U型模式，其擬合的EC50值為0.2nM（相較于傳統(tǒng)Boyden小室測(cè)得的EC50為0.1nM）。圖3B采用1nM MIP-1α作為趨化因子，同時(shí)加入不同濃度的CCR1拮抗劑——化合物6，在較高濃度的化合物6條件下，小室上表面未遷移的THP-1細(xì)胞更多，說(shuō)明化合物6抑制THP-1細(xì)胞的趨化。圖3C比較了6個(gè)CCR1拮抗劑用Incucyte® 與傳統(tǒng)Boyden小室趨化檢測(cè)結(jié)果，顯示出良好的一致性。

樹突狀細(xì)胞（DC）可以攝取和處理抗原、并轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)將處理后的抗原遞呈給初始T細(xì)胞，是最有效的抗原呈遞細(xì)胞（Antigen-presenting cells, APC）。研究表明iDC（未成熟細(xì)胞）表達(dá)CCR1、CCR2、CCR5、CXCR1、CXCR2和CXCR4，而mDC（成熟細(xì)胞）則表達(dá)CCR7和CXCR4。

CCR1配體MIP-1α和CCR2配體MCP-1可以特異性誘導(dǎo)iDC細(xì)胞趨化，并且顯示出明顯的劑量依賴性（EC50分別為0.16nM和5.6nM，圖4A和B），而對(duì)mDC無(wú)作用。CCR1抑制劑——化合物1特異性抑制MIP-1α（4nM）誘導(dǎo)的iDC趨化，CCR2抑制劑——化合物7特異性抑制MCP-1（20nM）誘導(dǎo)的iDC趨化（兩者的IC50為1.3nM和1.1nM，圖4C和D，對(duì)應(yīng)傳統(tǒng)Boyden小室檢測(cè)結(jié)果是1.9nM和1.7nM）。

CXCR4的配體SDF-1α特異性誘導(dǎo)mDC細(xì)胞趨化（EC50為13nM，圖4E），CXCR4特異性拮抗劑AMD3100的IC50為21nM(圖4F).

乳腺癌是一種高轉(zhuǎn)移性的常見癌癥，在正常乳腺組織中，CXCR4的表達(dá)較低；然而在原發(fā)乳腺腫瘤和轉(zhuǎn)移性乳腺癌里，CXCR4表達(dá)顯著增高，且與患者預(yù)后差相關(guān)。研究表明，CXCR4配體SDF-1α確實(shí)特異性誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的趨化（EC50為22nM，圖5A），CXCR4拮抗劑AMD3100抑制MDA-MB-231細(xì)胞的趨化（IC50為82nM，圖5B）。

作為細(xì)胞免疫的重要組成部分，文章還研究了CXCR4配體SDF-1α對(duì)活化的T淋巴細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg的趨化作用，對(duì)應(yīng)的EC50分別為33nM和22nM（圖6A和6C），CXCR4抑制劑AMD3100可以抑制兩種細(xì)胞的趨化，對(duì)應(yīng)的IC50為99nM和89nM（圖6B和6D）。

以SDF-1α介導(dǎo)的人急性T淋巴細(xì)胞CCRF-CEM趨化為例，分別用Incucyte® 與傳統(tǒng)Boyden小室方法定量檢測(cè)10種CXCR4抑制劑對(duì)CCRF-CEM趨化的影響，將兩種方法測(cè)得的IC50進(jìn)行相關(guān)性分析，其相關(guān)系數(shù)R2為 0.8（圖 7B）。在不同日期利用Incucyte® 進(jìn)行兩次獨(dú)立的趨化測(cè)定，其相關(guān)系數(shù)R2值為0.85（圖7C）。這均顯示了Incucyte®趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的良好重復(fù)性。

前面THP-1、DC、T細(xì)胞和貼壁腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的案例證明Incucyte® 趨化檢測(cè)的應(yīng)用廣、結(jié)果可信且重復(fù)性好，可用于癌癥轉(zhuǎn)移和免疫招募等相關(guān)疾病的藥物篩選中。雖然Incucyte® 趨化檢測(cè)相比傳統(tǒng)Boyden小室已實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)和自動(dòng)定量，但整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中仍涉及孔板包被、稀釋、移液和孔板轉(zhuǎn)移等手動(dòng)操作步驟，基于此，BMS利用實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化整合了一個(gè)高效的流程來(lái)建立自動(dòng)趨化檢測(cè)平臺(tái)（圖 8A）。以SDF-1α介導(dǎo)的Treg細(xì)胞趨化為例，8種CXCR4拮抗化合物自動(dòng)和手動(dòng)性檢測(cè)的IC50具有良好的相關(guān)性（R2為0.88，Z’因子為0.6，圖8B），說(shuō)明該自動(dòng)趨化檢測(cè)平臺(tái)的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性高。

除了文中提到的T 細(xì)胞（Treg細(xì)胞、活化的T細(xì)胞）、iDC 、mDC、THP-1和 MDA-MB-231 細(xì)胞，BMS公司還構(gòu)建了包括B 細(xì)胞、mTh17、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、A549 和 NHLF細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型的Incucyte® 趨化檢測(cè)模型。這些模型被廣泛應(yīng)用于免疫、腫瘤、心血管和纖維化相關(guān)的多個(gè)藥物研發(fā)項(xiàng)目中。

-參考文獻(xiàn)-

Chen J, Ribeiro B, Li H, Myer L, Chase P, Surti N, Lippy J, Zhang L, Cvijic ME. Leveraging the IncuCyte Technology for Higher-Throughput and Automated Chemotaxis Assays for Target Validation and Compound Characterization. SLAS Discov. 2018 Feb;23(2):122-131. doi: 10.1177/2472555217733437. Epub 2017 Sep 28. PMID: 28957636.