環(huán)氧合酶-2 (COX-2) ELISA說明書
日本IBL*,貨號:27186
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日本IBL中國*代理商,環(huán)氧合酶-2 (COX-2)簡介
COX是一種膜結合酶,負責花生烯酸氧化生成前列腺素G2(PGG2)以及隨后PGG2轉變?yōu)镻HG2。這是各種前列腺素生成的*步。COX至少有兩種不同的亞型,組成表達型COX-1,和誘導型COX-2。COX-1行使著看家功能,如血管止血,腎流血量,腎小球功能維護。COX-2存在于部分細胞內,發(fā)出炎癥信號,如生長因子,細胞因子和內毒素。
日本IBL中國*代理商,環(huán)氧合酶-2 (COX-2)實驗原理
試劑盒采用夾心酶免法,采用了兩種高特異性抗體,TMB作為著色劑,zui終溶液所顯示的顏色強度與樣品中COX-2的量成正比
檢測范圍
1.09~70ng/mL
日本IBL中國*代理商,環(huán)氧合酶-2 (COX-2)預期用途
1. 試劑盒可用于細胞上清裂解液中人COX-2的檢測
細胞培養(yǎng)液
1) 將細胞培養(yǎng)液(1x105~1x107個細胞)加入至0.5ml的IBL裂解液中(貨號為#19022)
2) 在振蕩器上混勻或用移液槍吹打混勻
3) 2-8℃下旋轉30min使其溶解
4) 2-8℃,10000rpm下離心10min
5) 有必要的話用EIA緩沖液稀釋上清液
2. 細胞裂解液試驗中,建議所用細胞數(shù)應一致
3. 建議總蛋白濃度也同時檢測,可檢測到人COX-2與總蛋白的關系
日本IBL中國*代理商,環(huán)氧合酶-2 (COX-2)試劑盒組成
1. 微孔板,96孔,包被有抗人COX-2鼠IgG單抗
2. 酶標抗體濃縮液,30X,HRP標記的抗COX-2兔IgG Fab片段,0.4ml
3. 標準品,重組人COX-2,0.5mlx2
4. EIA緩沖液,30ml
5. 酶標抗體稀釋液,內含的1%BSA、0.05%的吐溫20的PBS緩沖液,12ml
6. 顯色劑,TMB,15ml
7. 終止液,1N硫酸,12ml
8. 洗滌緩沖濃縮液,50ml,40X,0.05%吐溫20的磷酸緩沖液
日本IBL中國*代理商,環(huán)氧合酶-2 (COX-2)操作指南
實驗所需器材但試劑盒不提供
1. 酶標儀(450nm)
2. 微量移液器和取樣吸頭
3. 帶刻度的量筒與燒杯
4. 蒸餾水
5. 溫育器(37℃±1℃)
6. 冷床箱(4℃)
7. 坐標紙(log/log)
8. 吸水紙
9. 用于稀釋標準品的試管
10. 洗滌瓶
11. 酶標抗體稀釋的一次性試管
準備
1. 洗滌緩沖液制備:先將洗滌濃縮液平衡至室溫,充分混勻,然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻,即得。配制的洗滌液應保存于冰箱內,并于2周內用完
2. 標記抗體的制備:用標記抗體稀釋液將標記抗體稀釋30倍,即得。
例:如果只測一條板,8孔,則需要標記抗體800ul(30ul的標記抗體濃縮+870ul的標記抗體稀釋液,混勻,使用時每孔加100ul)
此步驟在實驗前完成
剩余的標記抗體濃縮應裝于密封瓶內,保存在4℃
3. 標準品的制備:吸取0.5ml的去離子水至標準品瓶內,充分混勻,得到140ng/ml的人COX-2標準品
4. 標準品的稀釋:準備8個試管用于標準品的稀釋,每管加入230ul的EIA緩沖液
每管的濃度如下
1號管 70 ng/ml
2號管 35ng/ml
3號管 17.5ng/ml
4號管 8.75ng/ml
5號管 4.38ng/ml
6號管 2.19ng/ml
7號管 1.09ng/ml
8號管 0pg/ml(試驗樣品空白)
吸取230ul的標準品于1號管混勻,然后從1號管吸取230ul加入2號管,依次連續(xù)稀釋,標準品范圍為70~1.09ng/ml
5. 樣品稀釋:樣品用EIA緩沖液稀釋
實驗步驟
使用前,所有樣品應平衡至室溫,大約30min,然后充分混勻,確保試劑質量無變化,標準曲線和樣品檢測同時進行
試劑 | 檢測樣品 | 標準品 | 檢測樣品對照孔 | 試劑對照孔 |
檢測樣品100ul | 稀釋標準品(1-7管)100ul | EIA緩沖液(第8管) 100ul | EIA緩沖液100ul | |
蓋板,37℃下孵育60min | ||||
洗板7次 | ||||
酶標抗體 | 100ul | 100ul | 100ul | - |
蓋板,4℃下孵育30min | ||||
洗板9次 | ||||
顯色劑 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
室溫避光溫育30min | ||||
終止液 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
加終止液后30min內450nm處讀取OD值 |
1. 確定好空白孔,并在相應的微孔中加入100ul EIA緩沖液。
2. 確定好樣品對照孔,檢測樣品孔和標準品孔,然后分別將100ul樣品對照品、檢測樣品和稀釋好的標準品加入到相應的微孔中。
3. 蓋板,37℃孵育60min
4. 用洗瓶洗板,在微孔中加入洗滌液再浸泡15-30秒,棄取洗滌液。重復7次,zui后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機洗板時,用洗板機洗四次后,再用洗瓶洗3次。
5. 每孔加入100ul酶標抗體。
6. 蓋板,4℃下溫育30min
7. 按照步驟4)洗板9次
8. 將所需量的顯色劑加入到試管中,然后每孔內加入100ul顯色劑。為了避免污染,請勿將剩余試劑倒入顯色劑原裝瓶中。
9. 室溫避光溫育30min,加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色
10. 每孔中加入100ul終止液,此時溶液顏色會變成黃色。
11. 除去包被板孔底的雜質或水滴,同時確保液體表面無泡沫, 30min內在450處讀取OD值。
特別注意
1. 樣品采集后應立即檢測,如需貯存的,則應放置在冰凍條件下,避免反復凍融,檢測前應在低溫下將其溶解并*混合
2. 如有需要,樣品可用EIA緩沖液稀釋
3. 建議試驗樣品和標準品做雙份檢測
4. 試驗樣品應在中性PH范圍內,有機溶劑的污染會影響試驗
5. 只能使用試劑盒內提供的洗滌液洗板,洗板不充足可能會導致試驗失敗
6. *倒去洗滌液,吸水紙上拍干,不能用吸水紙擦拭微孔
7. 底物液應避光保存,因其對光敏感,且要避免接觸金屬
8. 加入終止液后30min內讀數(shù)
結果計算
繪制標準曲線前,將所有的檢測孔(包括標準品和未知樣品)的OD值都減去檢測樣品空白孔的OD值。在對數(shù)坐標紙上,以標準品的OD值(減去空白后的值)對其相應的濃度,通過這些點作一條平滑的標準曲線。我們可以從標準曲線上讀取未知樣品的濃度值。
典型標準曲線
本譯文僅供參考,詳情請以原文為準。
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