該研究的亮點(diǎn)包括：

CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的經(jīng)典基因編輯技術(shù)^[2]，通過 Cas9 蛋白在 DNA 靶標(biāo)形成雙鏈斷裂（DSB），利用體內(nèi)的修復(fù)機(jī)制，產(chǎn)生定向插入、刪除等隨機(jī)修飾，但很難實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的單堿基替換。然而，單堿基變異可以導(dǎo)致很多已知疾病的發(fā)生，與日俱增的基因組測序研究也在積累大量意義不確定的點(diǎn)突變，因此堿基編輯器（BE）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生 ^[3]。與經(jīng)典的 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)相比，BE 技術(shù)主要對Cas9蛋白模塊做了修改，一方面將 Cas9 蛋白切割產(chǎn)生雙鏈斷裂功能失活，另一方面在失活的 Cas 蛋白上融合脫氨酶模塊，從而實(shí)現(xiàn)單堿基的替換，如將某位點(diǎn)的 C 轉(zhuǎn)換成 T 的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）。

本文就是在 CBE 的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了堿基編輯器“傳感器”工具，用來檢測多種 CBE 系統(tǒng)的編輯效率和精準(zhǔn)度。如圖 1 所示，在慢病毒載體上，將 sgRNA 序列與對應(yīng)的同源目標(biāo)序列順式連接，形成“傳感器”序列。將裝載不同“傳感器”序列的載體轉(zhuǎn)染到可以表達(dá)堿基編輯酶組分的細(xì)胞系后，可以實(shí)現(xiàn)高通量堿基編輯。通過進(jìn)一步對“傳感器”編碼區(qū)域進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增和高通量測序，就可以測量每個具體的“編輯器 +sgRNA+ 靶標(biāo)序列”的堿基編輯效率。

如圖 2 所示，為了使堿基編輯“傳感器”的元件設(shè)計(jì)更加簡便，作者團(tuán)隊(duì)搭建了一款設(shè)計(jì)算法 AMINEsearch。接下來，作者從腫瘤大 panel 檢測項(xiàng)目 MSK-IMPACT 的分析數(shù)據(jù)中提取了部分突變數(shù)據(jù)集，通過 AMINEsearch 軟件，設(shè)計(jì)出人的腫瘤傳感器文庫（HBES），共包括 5855 個 sgRNAs 序列、靶向 1450 個點(diǎn)突變。通過將 HBES 比對到小鼠的同源序列位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出針對小鼠的腫瘤傳感器文庫（MBES），共包括 4686 個 sgRNAs 序列、靶向 1177 個點(diǎn)突變。

值得一提的是，在初步構(gòu)建兩個文庫時，作者發(fā)現(xiàn)有將近一半的文庫序列發(fā)生了錯誤。在反復(fù)試錯和優(yōu)化后，最終通過與安捷倫合作，使用 SurePrint 高保真 OLS 平臺，才得以合成低錯誤率的“傳感器”序列。如作者所言，“這真的是我們可以合成傳感器結(jié)構(gòu)的唯一方式”。

在后續(xù)的文庫篩選中，HBES 和 MBES 被分別轉(zhuǎn)染到可以表達(dá)堿基編輯系統(tǒng)的細(xì)胞系 MDA-MB-231 中，共測試了三種堿基編輯系統(tǒng)。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，PAM 模式、目標(biāo)胞嘧啶位置和雙核苷酸序列背景對堿基編輯效率有顯著影響。為了進(jìn)一步探索不同細(xì)胞系的表現(xiàn)，作者又納入 4 種額外的細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)雖然不同細(xì)胞系的編輯效率不一，但在 PAM 偏好性、編輯窗口容許范圍和單一 sgRNA 序列編輯效率上是高度一致的。至此，本研究共檢測 20 萬種“堿基編輯器 -sgRNA- 細(xì)胞類型”的組合，為“傳感器”工具積累了充分?jǐn)?shù)據(jù)。除了關(guān)注目標(biāo)位點(diǎn) C-T 轉(zhuǎn)化結(jié)果，作者還對非靶標(biāo) C-T 轉(zhuǎn)化和非經(jīng)典的 C-G 顛換進(jìn)行分析，因篇幅限制不再贅述。

在利用“傳感器”工具在細(xì)胞內(nèi)引入堿基編輯時，此效應(yīng)會同時作用在傳感器同源序列和細(xì)胞的內(nèi)源序列。為了檢測兩種效應(yīng)間的一致性，作者進(jìn)行了 13 個 sgRNA 的小規(guī)模測試。結(jié)果表明（圖 4），在 50% 的情況下，內(nèi)源編輯效率與“傳感器”數(shù)據(jù)的差距在 10% 以內(nèi)，顯示了“傳感器”對內(nèi)源目標(biāo)編輯效率預(yù)測的有效性。

堿基“傳感器”的線上軟件工具 BE-SCAN 已經(jīng)開發(fā)，網(wǎng)站地址是 https://dowlab.shinyapps.io/BEscan/，可以為其他研究者提供驗(yàn)證數(shù)據(jù)參考和元件設(shè)計(jì)支持。

未來，Sánchez-Rivera 博士團(tuán)隊(duì)將把“傳感器”工具拓展到“先導(dǎo)編輯”技術(shù)中，進(jìn)一步擴(kuò)大該工具的基因編輯應(yīng)用范圍。

安捷倫 SurePrint 寡核苷酸合成平臺將繼續(xù)為廣大研究者提供最高質(zhì)量的底層工具，助力科學(xué)創(chuàng)新更進(jìn)一步！

掃描二維碼，觀看講座

CRISPR 基因編輯原理與應(yīng)用

參考文獻(xiàn)：

[1] Sánchez-Rivera, F.J., Diaz, B.J., Kastenhuber, E.R. et al. Base editing sensor libraries for high-throughput engineering and functional analysis of cancer-associated single nucleotide variants. Nat Biotechnol 40, 862–873 (2022).

[2] Martin Jinek et al. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity.Science337,816-821(2012).

[3] Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016).

[4] Kastenhuber, E. R. & Lowe, S. W. Putting p53 in context. Cell 170, 1062–1078 (2017).