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我們經(jīng)常遇到過這個問題：自己養(yǎng)的細胞開始長的還挺好的，可是凍存之后復蘇會發(fā)現(xiàn)細胞狀態(tài)不好甚至復蘇不起來。出現(xiàn)這種問題很有可能就是你的凍存環(huán)節(jié)出了問題。
當細胞冷到零度以下時，細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶，冰晶的大小對細胞有影響是不同的，大冰晶容易造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂，因此就會造成我們復蘇出來的細胞存活率、狀態(tài)等與凍存前的狀態(tài)相差甚遠。那么我們要怎么解決這些問題呢？
首先我們在凍存的過程中要減少冰晶的形成，尤其是大冰晶的形成：緩慢凍存細胞，可使細胞內(nèi)避免產(chǎn)生大的冰晶。
那么我們該怎樣凍存細胞呢？
一、慢凍細胞
1、常規(guī)程序：
使用程序降溫盒
當溫度在-25℃以上時，1-2℃/min。
當溫度在-25℃以下時，5-10℃/min。
當溫度達到-100℃時，可迅速轉(zhuǎn)入液氮中。
2、簡易程序：
冷凍管管口朝上，放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘下降1-2℃的速度，在40min內(nèi)降至液氮表面過夜，次晨投入液氮中。
3、傳統(tǒng)程序：
冷凍管置于4℃10min，-20℃30min，-80℃16-18h（或隔夜），液氮長期儲存。
二、低溫保護劑
常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透保護劑，可迅速透入細胞，提高細胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。
三、細胞凍存方法
1、預先配制凍存液：
凍存液比例多種，根據(jù)細胞的特性進行調(diào)整凍存液的比例：
5%—10%DMSO+20%—90%血清+0%—70%基礎培養(yǎng)液；
2、取對數(shù)生長期的細胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗1-2次；去掉培養(yǎng)瓶里的殘余血清；
3、加入適量胰酶（濃度一般為0.25%），使胰酶覆蓋整個瓶，放入培養(yǎng)箱消化；
4、細胞消化0.5-2min（具體時間根據(jù)鏡下形態(tài)判斷），顯微鏡下觀察細胞，細胞胞質(zhì)回縮，細胞間不再連接成片，此時加入培養(yǎng)基終止消化；
5、用巴氏吸管輕輕吹打細胞，形成細胞懸液，將細胞懸液1000r/min左右條件下離心3-5min；
6、棄上清，加入適量預先配制好的凍存液，巴氏吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中的細胞最終密度為5×106/ml～1×107/ml；
7、將細胞分裝入凍存管中，每管1-1.5ml；
8、凍存管標記細胞名稱，凍存時間，操作者及細胞代數(shù)信息。
對于懸浮細胞凍存，則直接收集離心細胞，除去胰酶消化的步驟，其他步驟相同。
注意事項
1、需凍存保種的細胞應在生長良好且存活率高，其密度約為80-90％的狀態(tài)。細胞凍存前應保證細胞的活力好，無污染。
2、在細胞凍存過程中，所結(jié)的冰晶對細胞傷害較大，所以過程一定要慢。凍存或者復蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。
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