小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的常駐巨噬細(xì)胞，參與CNS穩(wěn)態(tài)。為了應(yīng)對損傷，小膠質(zhì)細(xì)胞將其狀態(tài)/極化從經(jīng)典的 M1 表型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ畹?nbsp;M2 表型，M1表型通過分泌促炎細(xì)胞因子和活性氧、活性氮物質(zhì)對神經(jīng)元有毒性，而M2表型分泌抗炎細(xì)胞因子，具有增強(qiáng)的吞噬活性，并釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子。事實(shí)上，抑制促炎M1小膠質(zhì)細(xì)胞并促進(jìn)它們轉(zhuǎn)變?yōu)楸Ｗo(hù)和抗炎的M2表型可能被證明是治療神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病，如阿爾茨海默?。?/span>AD），的重要治療策略。

人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（hAD-MSCs）在臨床治療中特別有希望，因?yàn)樗鼈兛梢允褂梦?chuàng)技術(shù)從患者身上輕松且可重復(fù)地收集。在與AD相關(guān)的動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中，hAD-MSCs已被證明通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)以及小膠質(zhì)細(xì)胞增殖，極化和吞噬活性來改善AD疾病癥狀。這種效應(yīng)的機(jī)制已被證明，部分是由于MSCs通過其分泌組的旁分泌活性，包括可溶性細(xì)胞因子，生長因子和細(xì)胞外囊泡（EVs）的釋放。EVs是分泌的小（直徑約30-200 nm）脂質(zhì)囊泡，通過在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移RNA、DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，已成為細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)。最近的研究表明，EVs還可以將小膠質(zhì)細(xì)胞從M1極化為M2表型。鑒于EVs具有低免疫原性，因此它們作為潛在的無細(xì)胞療法具有巨大潛力。

目前，很少有研究通過關(guān)注其免疫調(diào)節(jié)表型來研究人類小膠質(zhì)細(xì)胞中hAD-MSCs及其分泌的EVs的潛在機(jī)制。鑒于小鼠炎癥模型中的基因組反應(yīng)與人類基因組變化沒有很好的相關(guān)性，美國斯坦福大學(xué)放射學(xué)系的課題組研究了hAD-MSCs及其EVs在人小膠質(zhì)細(xì)胞系（人小膠質(zhì)細(xì)胞HMC3）中的作用。

脂多糖（LPS）對HMC3細(xì)胞的影響

為了評估不同程度的toll樣受體4（TLR4）激活的效果，將HMC3細(xì)胞與增加濃度（0.01-10 μg/ml）的脂多糖（LPS）孵育24小時(shí)。在低濃度的LPS下，HMC3細(xì)胞具有激活小膠質(zhì)細(xì)胞的特征，呈阿米巴樣形態(tài)（圖1 A、B）。此外，LPS增加了小膠質(zhì)細(xì)胞的β-整合素標(biāo)志物 CD11b的表達(dá)（圖1 B）。雖然在低濃度（0.1-1 μg/ml）的LPS下存在小膠質(zhì)細(xì)胞活化，但較高濃度（10 μg/ml）可導(dǎo)致細(xì)胞死亡（圖1 B）。數(shù)據(jù)顯示，即使在較低濃度 ≤1 μg/ml下，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）也會積累（圖1 D）。為了進(jìn)一步了解炎癥對HMC3細(xì)胞的影響，測量了1 μg/ml LPS處理和對照細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中細(xì)胞因子和趨化因子的相對表達(dá)（圖1 E、F），在這里，單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和IL-8在LPS激活后均增加。

圖1   LPS對HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

（A）顯示了用不同劑量的LPS孵育24小時(shí)后HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化。（B）對CD11b（綠色熒光信號）、鬼筆環(huán)肽（白色）和核DAPI染色（藍(lán)色）進(jìn)行免疫熒光染色。（C）用不同劑量的LPS孵育24小時(shí)后的細(xì)胞活力通過XTT測定法測定。（D）使用Celigo成像細(xì)胞儀確定響應(yīng)24小時(shí)LPS暴露的HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的ROS生成。（E）相對細(xì)胞因子表達(dá)的熱圖。（F）相對細(xì)胞因子表達(dá)的表征。

hAD-MSCs及其分泌的EVs的表征

hAD-MSCs具有典型的MSC紡錘形和多極形態(tài)。為了確定hAD-MSCs分泌的EVs的作用，實(shí)驗(yàn)收集了條件培養(yǎng)基和EVs。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，與細(xì)胞裂解物相比，分離的EVs和CM中的CD63（經(jīng)典EVs標(biāo)志物）富集。

分析來自hAD-MSCs的分泌組，顯示TIMP-1、IL-6和IL-8的表達(dá)增加，事實(shí)上，與親本間充質(zhì)干細(xì)胞相比，這些細(xì)胞因子在EVs中高度表達(dá)。

HMC3細(xì)胞與hAD-MSC或其分泌的EVs共培養(yǎng)

未處理和激活的（1μg/ml LPS）HMC3細(xì)胞與不同比例的hAD-MSCs和EVs共培養(yǎng)24小時(shí)（圖2 A）。當(dāng)未經(jīng)處理的HMC3細(xì)胞與hAD-MSCs共培養(yǎng)時(shí)，它們顯示出典型的細(xì)長、分枝狀小膠質(zhì)細(xì)胞靜息形態(tài)，類似于上述對照實(shí)驗(yàn)（圖1 A）。添加LPS（1 μg/ml）導(dǎo)致HMC3細(xì)胞形成阿米巴樣形態(tài)，與200，000和100，000個(gè)hAD-MSCs細(xì)胞（圖2 B）或 20 和 10 μg/ml 的 EVs（圖2 C）共培養(yǎng)時(shí)，阿米巴樣形態(tài)細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。

圖2   人HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞與人脂肪組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞或細(xì)胞外囊泡的共培養(yǎng)

（A）共培養(yǎng)方案的示意圖概述。（B）在存在或不存在 1 μg/ml LPS 的情況下培養(yǎng) HMC3 小膠質(zhì)細(xì)胞（綠色）和人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（紅色）的熒光圖像。（C）在存在或不存在 1 μg/ml LPS 的情況下培養(yǎng)的 HMC3 小膠質(zhì)細(xì)胞（綠色）和人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞外囊泡（紅色）的熒光圖像。

激活的HMC3細(xì)胞與hAD-MSCs或其分泌的EVs共培養(yǎng)后的表征

為了研究對小膠質(zhì)細(xì)胞表型極化的影響，用1 μg/ml LPS激活HMC3細(xì)胞24小時(shí)，然后與hAD-MSCs或其分泌的EVs共培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)對CD11b進(jìn)行了免疫熒光染色，CD11b可檢測F-肌動(dòng)蛋白（圖3 A）。如前所述，與未處理的HMC3細(xì)胞相比，LPS處理上調(diào)了CD11b表達(dá)和阿米巴樣形態(tài)。然而，當(dāng)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞與hAD-MSCs或其EVs共培養(yǎng)時(shí)，CD11b表達(dá)降低，阿米巴樣形態(tài)24小時(shí)后可見（圖3 A）。

LPS激活后，HMC3細(xì)胞中誘導(dǎo)的一氧化氮合酶（iNOS）的量顯著增加，從1.49增加到98.51（圖3 B、C）。相反，在存在hAD-MSCs和hAD-MSC EVs的情況下，在所有比率下，iNOS的水平均顯著降低（圖3 C）。此外，觀察到標(biāo)記的酵母聚糖顆粒被用LPS處理的HMC3細(xì)胞吞噬。然而，當(dāng)HMC3細(xì)胞與hAD-MSCs共培養(yǎng)時(shí)，這種效應(yīng)受到抑制，但當(dāng)它們與hAD-MSC EVs共培養(yǎng)時(shí)，這種效應(yīng)不受抑制。

圖3   hAD-MSCs對小膠質(zhì)細(xì)胞免疫炎癥表型的影響

（A）M1 標(biāo)記物 CD11b（綠色）、F-肌動(dòng)蛋白鬼筆環(huán)肽（白色）和 DAPI（藍(lán)色）的免疫熒光染色。hAD-MSCs用CellBrite Orange （紅色）標(biāo)記。（B）誘導(dǎo)性一氧化氮（iNOS）的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。（C）蛋白質(zhì)印跡定量。iNOS誘導(dǎo)型一氧化氮。

激活的HMC3細(xì)胞分泌細(xì)胞因子

在存在或不存在hAD-MSCs或EVs的情況下，實(shí)驗(yàn)確定了HMC3激活或非激活小膠質(zhì)細(xì)胞中的細(xì)胞因子分泌（圖4 A、B）。LPS激活HMC3細(xì)胞后，與未處理的小膠質(zhì)細(xì)胞相比，IL-6增加了四倍，IL-8增加了五倍（圖4 C-F）。用hAD-MSCs處理減弱了激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-8以及IL-6的分泌（圖4 C、E）。相比之下，在hAD-MSC EVs存在的情況下，IL-8或IL-6的分泌上調(diào)（圖4 D、F）。同樣，HMC3細(xì)胞的活化導(dǎo)致MCP-1增加兩倍，hAD-MSCs（50，000個(gè)細(xì)胞）和hAD-MSC EVs（50和20 μg/ml）均降低MCP-1，且EVs的作用更大（圖4 D、F）。此外，在活化小膠質(zhì)細(xì)胞中，TIMP-1的蛋白質(zhì)水平也被EVs顯著上調(diào)，并通過高hAD-MSCs劑量（200，000和100，000個(gè)細(xì)胞）下調(diào)，而IL-10水平被更高劑量的hAD-MSCs EVs（50和20 μg/ml）上調(diào)。BDNF蛋白表達(dá)也被EVs上調(diào)，并通過所有hAD-MSCs劑量下調(diào)（圖4 E、F）。

圖4   由人脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞和細(xì)胞外囊泡介導(dǎo)的未經(jīng)處理或LPS刺激的HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞因子產(chǎn)生的變化

（A）細(xì)胞因子陣列的基因圖譜。（B）共培養(yǎng)細(xì)胞因子陣列和人脂肪組織來源的干細(xì)胞或細(xì)胞外囊泡的圖像。（C、D）相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的熱圖。（E、F）細(xì)胞因子的相對表達(dá)。

總之，該研究證明了hAD-MSCs及其分泌的EVs可以預(yù)防促炎小膠質(zhì)細(xì)胞表型。這些發(fā)現(xiàn)支持hAD-MSC EVs作為治療包括AD在內(nèi)的神經(jīng)炎癥性疾病的潛在無細(xì)胞療法的作用。未來需要進(jìn)一步的研究來確定hAD-MSC分泌的EVs的含量及其作用的不同分子機(jī)制，以了解它們?nèi)绾卧诩?xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型中精確調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞。

參考文獻(xiàn)：Garcia-Contreras M, Thakor AS. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and their extracellular vesicles modulate lipopolysaccharide activated human microglia. Cell Death Discov. 2021 May 10;7(1):98. doi: 10.1038/s41420-021-00471-7. PMID: 33972507; PMCID: PMC8110535.

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