化學(xué)發(fā)光法生物素標(biāo)記核酸檢測試劑盒的應(yīng)用！

一、背景

化學(xué)發(fā)光法生物素檢測試劑盒(Chemiluminescent Biotin-labeled Nucleic Acid Detection Kit)是一種通過Streptavidin-HRP及后續(xù)的BeyoECL Star試劑來實現(xiàn)化學(xué)發(fā)光檢測Biotin標(biāo)記核酸的檢測試劑盒。適用于Southern blot、Northern blot、ribonuclease protection assay(RPA)或EMSA等實驗中，采用生物素標(biāo)記的DNA或RNA探針時的檢測。本試劑盒不適用于生物素標(biāo)記蛋白的檢測。

化學(xué)發(fā)光法生物素標(biāo)記核酸檢測試劑盒同時還提供了封閉液、洗滌液等檢測時所需的配套試劑?；瘜W(xué)發(fā)光法生物素標(biāo)記核酸檢測試劑盒采用了高質(zhì)量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共價交聯(lián)的比例大于3，這樣比采用Streptavidin和Biotin-HRP conjugate兩種試劑進行檢測要更方便，并且靈敏度更高?；瘜W(xué)發(fā)光法生物素標(biāo)記核酸檢測試劑盒采用了非特異性結(jié)合比avidin更低的strepatavidin，使檢測結(jié)果背景更低靈敏度更高?；瘜W(xué)發(fā)光法生物素標(biāo)記核酸檢測試劑盒沒有提供生物素探針標(biāo)記相關(guān)的試劑，生物素標(biāo)記的DNA探針或EMSA探針的制備可以相應(yīng)地使用生物素3'末端DNA標(biāo)記試劑盒或EMSA探針生物素標(biāo)記試劑盒。

二、使用說明

1、在使用Biotin標(biāo)記探針的情況下，完成Southern、Northern雜交及后續(xù)洗滌后，或RPA的轉(zhuǎn)膜和交聯(lián)后，或EMSA的轉(zhuǎn)膜和交聯(lián)后，可以使用本試劑盒開始檢測。下面的檢測過程中溶液的用量是用于一片10x10cm膜的量。如果膜較大或較小，各溶液的用量可以按比例放大或縮小。

2、37-50℃水浴溶解封閉液和洗滌液。

3、取一合適的容器加入15ml封閉液，再放入交聯(lián)過的含有樣品的尼龍膜。在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鐘。

4、取5微升Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封閉液中(1:3000稀釋)，混勻備用。

5、去除封閉液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封閉液。在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鐘。

6、取25ml洗滌液(5X)，加入100ml重蒸水或MilliQ級純水，混勻配制成125ml洗滌液。

7、將尼龍膜轉(zhuǎn)移至另一裝有15-20ml洗滌液的容器內(nèi)，漂洗1分鐘。

8、去除洗滌液，加入15-20ml洗滌液，在側(cè)擺搖床或水平搖床緩慢上洗滌5分鐘。

9、重復(fù)步驟8三次(共洗滌四次)，每次洗滌時間均約為5分鐘。

10、將尼龍膜轉(zhuǎn)移至另一裝有20-25ml檢測平衡液的容器內(nèi)，在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動5分鐘。

11、取5ml ECL Reagent A和5ml ECL Reagent B混勻，配制成ECL Reagent工作液。

12、取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。立即將膜的樣品面向上，放置到處于水平桌面上的潔凈容器內(nèi)或保鮮膜上。

13、在尼龍膜的表面小心加上步驟11配制好的共10ml ECL Reagent工作液，使工作液*覆蓋尼龍膜。室溫放置2-3分鐘。

14、取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。將尼龍膜放在兩片保鮮膜或其它適當(dāng)?shù)耐腹獗∧ぶ虚g，并固定于壓片暗盒(也稱片夾)內(nèi)。

15、用X光片壓片1-5分鐘?？梢韵葔浩?分鐘，立即顯影定影，然后根據(jù)結(jié)果再調(diào)整壓片時間；也可以直接分別壓片30秒、1、3、5分鐘或更長時間，然后一起顯影定影觀察結(jié)果。

三、應(yīng)用

用于基于納米磁分離和化學(xué)發(fā)光的肝炎分子檢測新技術(shù)研究：

以肝炎為檢測對象,結(jié)合化學(xué)發(fā)光和磁分離技術(shù)的優(yōu)點,建立了幾種快速、高通量、靈敏和實用的肝炎分子檢測新技術(shù)。具體內(nèi)容包括：

1、功能化磁性納米顆粒的制備及在核酸提取中應(yīng)用為提高磁性納米顆粒功能化結(jié)合分子檢測探針量,本章在進行乙肝樣本高靈敏檢測研究前對傳統(tǒng)功能化磁性納米顆粒的制備方法進行了改進,首先采用軟模板法制備Fe304磁性納米顆粒,并進行包被SiO2實驗。包被前平均直徑為500 nm,且為圓顆粒,大小比較均一,具有超順磁性,飽和磁化強度為1.7374emu/g,制備的包被SiO2復(fù)合Fe3O4顆粒大小,平均粒徑為700nm,制備后的Fe3O4@SiO2具有明顯的核殼結(jié)構(gòu),具有較好的分散性,顆粒為圓形,大小均一。將磁性納米顆粒應(yīng)用于細菌和全血樣本核酸提取中均獲得良好的提取效果,有望開發(fā)出磁珠分離法核酸提取試劑盒。

2、基于功能化磁性納米顆粒的肝炎核酸分子提取及擴增首先針對不同來源的兩種乙肝核酸提取方法提取效果進行比較分析,并對提取出來的乙肝核酸樣品進行驗證性實驗分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清肝炎病毒核酸提取量雖少,但可以應(yīng)用于PCR擴增,而應(yīng)用于全基因組擴增效果較差。與此同時,全血中核酸提取量較高,一方面可以用于PCR擴增,還可應(yīng)用于全基因組擴增技術(shù),這樣就起到了對肝炎核酸分子富集放大的作用。經(jīng)過全基因組擴增的全血乙肝核酸DNA還可以進行PCR擴增。本章還對全血乙肝核酸DNA的全基因組擴增條件進行優(yōu)化分析,這為今后利用化學(xué)發(fā)光的高通量多樣本測定乙肝分子檢測打下了基礎(chǔ)。

3、基于納米磁分離和化學(xué)發(fā)光的乙肝PCR擴增檢測方法的建立及優(yōu)化本章以生物素標(biāo)記的乙肝HBV DNA為目標(biāo)分子,建立了一種乙肝核酸分子的化學(xué)發(fā)光雜交檢測方法,結(jié)果表明,該方法的特異性較好。通過對檢測體系中涉及到的多種實驗條件進行優(yōu)化處理,對整個檢測方法有了更深入的了解,并得出了化的實驗條件,有望提高該方法的檢測靈敏度。