富士膠片株式會社 生命科學(xué)＆工程研究所

福地 大樹

◆前言

內(nèi)毒素是存在于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的脂多糖（Lipopolysaccharide），進(jìn)入血液后，只需極少量即可引發(fā)出發(fā)熱癥狀，大量存在則表現(xiàn)出強(qiáng)毒性，可導(dǎo)致內(nèi)毒素休克甚至死亡^1）。由于革蘭氏陰性菌廣泛分布于環(huán)境中，存在混入生產(chǎn)過程的風(fēng)險，而混入的內(nèi)毒素具有耐熱性，不易滅活，因此要求注射劑和醫(yī)療器械接受嚴(yán)密的內(nèi)毒素污染管理。近年備受關(guān)注的再生醫(yī)療、疫苗、抗體和核酸醫(yī)藥相關(guān)的產(chǎn)品，內(nèi)毒素管理對這類產(chǎn)品而言非常重要。

目前檢測主流是使用一種利用了馬蹄蟹血細(xì)胞提取物成分凝血系統(tǒng)的試劑——鱟試劑，來檢測內(nèi)毒素，但為了保護(hù)鱟科、穩(wěn)定供應(yīng)鱟試劑、減少產(chǎn)品批間差異、提高檢測穩(wěn)定性，各鱟試劑廠家開始促進(jìn)使用人工原料生產(chǎn)的重組蛋白來研發(fā)內(nèi)毒素檢測試劑。

◆內(nèi)毒素檢查法的檢測原理

      內(nèi)毒素檢查法是使用從馬蹄蟹血細(xì)胞成分制備得到的裂解試劑進(jìn)行內(nèi)毒素檢測或定量的方法。馬蹄蟹的血細(xì)胞提取物成分具有使內(nèi)毒素凝固的反應(yīng)體系，這種凝固反應(yīng)以多個絲氨酸蛋白酶前體依次活化的級聯(lián)反應(yīng)為基礎(chǔ)（圖1）。

      內(nèi)毒素激活馬蹄蟹血細(xì)胞提取物中含有的C因子，隨后活化C因子激活B因子?；罨疊因子再激活凝血酶原，激活的凝血酶將凝血蛋白原底物水解，并將其轉(zhuǎn)化為凝固蛋白，生成不溶性凝膠。

      另外，在馬蹄蟹血細(xì)胞提取物中，級聯(lián)反應(yīng)還會以G因子為起點，與β-葡聚糖發(fā)生反應(yīng)，由β-葡聚糖引起凝血反應(yīng)（圖1）。若想要特異性檢測內(nèi)毒素，需要通過去除G因子或抑制以G因子為起點的級聯(lián)反應(yīng)來檢測。

圖1. 由內(nèi)毒素、β-葡聚糖引起的凝血級聯(lián)反應(yīng)

◆內(nèi)毒素的檢測方法

內(nèi)毒素檢測大致可分為以下3種：凝膠法（以裂解物試劑的凝膠形成作為指標(biāo)）、濁度法（檢測伴隨凝膠化變化的吸光度或透射率來測定濁度變化）、顯色法（以合成底物水解產(chǎn)生的顯色作為指標(biāo)）。顯色法比凝膠法、濁度法的靈敏度要高。利用重組蛋白的內(nèi)毒素檢測試劑中，除了使用顯色合成底物的顯色法之外，還有熒光合成底物的檢測方法。

◆利用重組蛋白的內(nèi)毒素檢測試劑

      目前各公司銷售的重組蛋白內(nèi)毒素檢測試劑可分為兩種，使用C因子重組蛋白的單因子鱟試劑和使用C因子、B因子、凝血酶原重組蛋白的三因子鱟試劑（圖2）。

      單因子試劑由于級聯(lián)反應(yīng)沒有放大，產(chǎn)生的蛋白酶活性小，需要使用熒光底物進(jìn)行熒光檢測。三因子體系試劑與單因子體系試劑相比，酶活性較大，可產(chǎn)生顯色反應(yīng)，因此可以用普通的酶標(biāo)儀來檢測。

      另外，近年有報告稱，B因子對內(nèi)毒素的特異性具有重要作用^{2，3）}，相比只含有C因子的單因子鱟試劑，含C因子、B因子和凝血酶原三因子鱟試劑更接近于天然鱟試劑。富士膠片和光一直致力于研發(fā)三因子重組鱟試劑，目前最新推出的使用重組蛋白的重組鱟試劑（PYROSTAR™ Neo），有著良好的檢測性能。

圖2. 利用重組蛋白的內(nèi)毒素檢測試劑種類

◆PYROSTAR™ Neo

本次富士膠片和光發(fā)售的重組鱟試劑PYROSTAR™ Neo，具有以下的特點：對空白值進(jìn)行了控制，空白值更低，因此可檢測到更低的內(nèi)毒素濃度（表1）。另外，使用顯色法進(jìn)行檢測是裂解試劑的常規(guī)分析方法之一，重組鱟試劑PYROSTAR™ Neo檢測和分析時可使用能夠進(jìn)行動力學(xué)測定的恒溫酶標(biāo)儀和軟件進(jìn)行讀數(shù)。PYROSTAR™ Neo可以定量0.001 EU/mL~50 EU/mL范圍內(nèi)的內(nèi)毒素濃度，并能夠獲得線性良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線（相關(guān)系數(shù)在0.980以上）。

表1. PYROSTAR™ Neo與其他公司產(chǎn)品的比較

◆結(jié)語

目前內(nèi)毒素檢測試劑多為以鱟血為原料的裂解液鱟試劑，而使用人工重組蛋白的內(nèi)毒素檢測試劑，其歷史較短，并未得到廣泛應(yīng)用。

在此背景下，為推進(jìn)重組鱟試劑的應(yīng)用，2021年歐洲藥典收錄了采用熒光法的重組C因子鱟試劑并作為常規(guī)檢測方法。在日本藥典第十八次修訂的最新版本中，收錄了《內(nèi)毒素檢測方法與使用重組鱟試劑的替代法》（「エンドトキシン試験法と測定試薬に遺伝子組換えタンパク質(zhì)を用いる代替法」）作為補(bǔ)充參考信息，但重組鱟試劑并不屬于內(nèi)毒素檢查法中規(guī)定的“馬蹄蟹血細(xì)胞提取物成分制備的裂解試劑”。同樣，美國藥典也將重組鱟試劑視為替代法。據(jù)報告，使用替代法時，相比使用裂解試劑的內(nèi)毒素檢查法，需要對這兩種方法進(jìn)行對比研究，確保重組鱟試劑有相同或更高水平的真實性、準(zhǔn)確度、靈敏度、特異性等 ^4）。

今后富士膠片和光將會繼續(xù)推進(jìn)重組鱟試劑應(yīng)用于內(nèi)毒素檢測中的研究，但需滿足真實性、準(zhǔn)確度、靈敏度、特異性這幾點才能滿足考慮替代法的制藥公司等用戶的需求。我們將繼續(xù)推進(jìn)鱟試劑的研究，努力實現(xiàn)用戶需求、環(huán)境和馬蹄蟹保護(hù)之間的平衡。

◆參考文獻(xiàn)

1）棚元憲一：エンドトキシンと醫(yī)薬品の品質(zhì)管理，國立醫(yī)薬品食品衛(wèi)生研究所報告，126，19（2008）.

2）Kobayashi, Y. et al. : J. Biol. Chem., 290, 19379 (2015).

3）Tsuchiya, M. : Int. J. Dev. Res., 10, 36751 (2020).

4）菊池裕 他：醫(yī)薬品醫(yī)療機(jī)器レギュラトリーサイエンス，48，252（2017）.

◆相關(guān)產(chǎn)品

內(nèi)毒素檢測重組鱟試劑 PYROSTAR™ Neo：http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/908.html