波多野结衣中文无码,一区二区三区中文字幕人妻,日本福利一区二区三区四区,久久er99精品国产一区

產品推薦:氣相|液相|光譜|質譜|電化學|元素分析|水分測定儀|樣品前處理|試驗機|培養(yǎng)箱


化工儀器網>技術中心>工作原理>正文

歡迎聯系我

有什么可以幫您? 在線咨詢

基于高光譜成像技術單壁碳納米管用于溶酶體脂質通量的監(jiān)測

來源:北京心聯光電科技有限公司   2022年04月27日 12:06  

溶酶體是分解細胞內脂質、蛋白質、糖類及其他物質的細胞器,如果溶酶體分解機制發(fā)生“故障”,則導致底物(如脂質和糖蛋白)在溶酶體腔內積累,誘發(fā)溶酶體儲存障礙類疾病(LSDs)。目前,因缺少對上述疾病的認知,已開發(fā)的用于治療上述疾病的小分子還十分有限,且僅能測定細胞內脂質的含量。因此,開發(fā)出一種專門定位于溶酶體細胞器內腔并及時對脂質含量做出響應的探針極其迫切。單壁碳納米管(SWCNTs)可以在近紅外(NIR)區(qū)域發(fā)出窄帶隙的高穩(wěn)定性熒光,這類熒光對局部擾動十分敏感,可以通過溶劑化顯色反應對局部微環(huán)境變化做出響應?;诖耍?017年,DanielA. Heller教授課題組在《ACSNano》上發(fā)表了題為“ACarbon Nanotube Optical Reporter Maps Endolysosomal Lipid Flux”的文章,報道了其在小分子探針領域的取得的研究成果。在該論文中作者們構建了一種生物相容性良好的“光學報告器”,該報告器可以特異性定位在活細胞的溶酶體腔內,而對細胞器的形態(tài)、消化底物的能力、細胞活力、增殖沒有影響。ss(GT)6-(8,6)對脂質含量變化的響應性作者們通過非共價鍵將SWCNTs與DNA結合在一起,采用高效液相色譜法(HPLC)對不同長度的SWCNTs進行分離,并通過低密度的脂質蛋白(LDL)誘導發(fā)射波長藍移,篩選出具有較大藍移位移的DNA-CNTs復合物,命名為ss(GT)6-(8,6)。借助于高光譜顯微鏡,獲得了在七種不同溶劑環(huán)境中ss(GT)6-(8,6)復合物與溶劑介電常數的關系,證實了ss(GT)6-(8,6)復合物與溶劑介電常數相關,分子動力學模擬也表明低介電常數會使ss(GT)6-(8,6)復合物的發(fā)射波長藍移(圖1)。



圖1. ss(GT)6-(8,6)對脂質的響應;(a)標準化吸收-發(fā)射光譜;(b)發(fā)射波長與膽固醇-PEG濃度的函數;(c)不同溶劑中的平均發(fā)射波長;(d)分子動力學模擬平衡結構示意圖;(e)水分子密度與SWCNTs表面距離的函數作者們使用熒光顯微鏡對ss(GT)6-(8,6)復合物與哺乳動物細胞之間的相互作用進行了探究。將巨噬細胞置于含0.2 mg/L ss(GT)6-(8,6)復合物的10%血清(FBS)中培養(yǎng),用新鮮的無復合物培養(yǎng)液沖洗,顯微鏡下巨噬細胞發(fā)出強烈的熒光,說明ss(GT)6-(8,6)復合物與細胞緊密結合在了一起,37℃之下培養(yǎng)的巨噬細胞的熒光強度是4℃下的十倍,說明細胞對于ss(GT)6-(8,6)復合物的內吞作用有很強的能量依賴性。ss(GT)6-(8,6)在細胞內的定位作者們對巨噬細胞進行了一系列的成像實驗確定了ss(GT)6-(8,6)復合物在細胞內的位置。使用Cy3對DNA進行標記,分別在NIR和可見光區(qū)域對DNA-CNTs進行成像,兩種情況下所觀察到的熒光信號在細胞內的位置相同,說明結合到CNTs上DNA是定位CNTs的可靠指示劑。然后作者們用Lyso Tracker Green對Cy5標記ss(GT)6-(8,6)復合物進行定位,結果表明Cy5和Lyso Tracker Green之間存在共域化,皮爾遜相關系數為0.92 ± 0.036,曼德斯分裂共域系數為0.95 ± 0.018,說明CNTs的發(fā)射信號源在溶酶體內腔,另外,CNTs的NIR發(fā)射源位置與Lyso Tracker Green發(fā)射源位置相同,這在一定程度上也支撐了上述結論。Au納米顆粒標記CNTs的TEM圖也表明CNTs位于溶酶體腔內(圖2- 4)。


圖2:Cy3標記的ss(GT)6-(8,6)復合物在NIR和可見光區(qū)域的熒光成像

圖3:Cy5標記的ss(GT)6-(8,6)和Lyso Tracker Green在活細胞內的熒光成像


圖4:ss(GT)6-(8,6)在細胞內的定位;(a)Cy5標記的ss(GT)6-(8,6)和Lyso Tracker Green在活細胞內的熒光成像;(b)TMR-dextran和Alexa-647-SWCNT在U2OS-SRA cells中的共聚焦成像;(c)高斯擬合之后的TMR和Alexa 647的強度分布圖;(d)AuNP?SWCNT的TEM圖像;(e)AuNP?SWCNT在溶酶體腔內的TEM圖像;(f)每個溶酶體細胞器內AuNP?SWCNT相對頻率分布直方圖;(g)實驗中測得的AuNP?SWCNT的頻率分布直方圖以及預測的游離AuNP頻率分布直方圖ss(GT)6-(8,6)的生物相容性為了評價ss(GT)6-(8,6)復合物在哺乳動物細胞內的生物相容性。作者們首先利用0.2 mg/L的annexinV和PI進行實驗,結果表明ss(GT)6-(8,6)復合物不會影響細胞的存活和增值。TEM結果也表明ss(GT)6-(8,6)不會影響內體性溶酶體細胞器的形態(tài)。更高濃度(1 nm/L)的ss(GT)6-(8,6)復合物的含量也不會影響內溶酶體細胞器的通透性。作者們?yōu)榱嗽u價ss(GT)6-(8,6)復合物是否會影響內溶酶體維持自身pH的能力,便采用特異性吸附到酸性小泡內部的一種內溶酶體熒光探針(LysoTracker)對細胞內pH水平的變化進行了評價,結果顯示,無論是添加或不添加ss(GT)6-(8,6)復合物,LysoTracker的熒光強度均無顯著差異。作者們還探究了添加DNA-CNTs對溶酶體水解脂類蛋白的影響,作用1 mg/L的Alexa-SWCNTs處理U2OS-SRA細胞,并在細胞培養(yǎng)液中添加50 μg/mL的Alexa 488-AcLDL以誘導細胞吸收脂類蛋白。研究表明,添加或不添加DNA-CNTs的細胞在脂類分解水平上沒有差異。此外,脂質生化分析也表明,包含CNTs的細胞與不含CNTs的細胞的膽固醇和總脂質含量均無明顯差異,脂毒素成像與低密度脂蛋白受體的表達也表明ss(GT)6-(8,6)復合物不會影響細胞器對細胞內脂質的處理(圖5)。

圖5:ss(GT)6-(8,6)復合物對溶酶體功能的影響;(a)在U2OS-SRA細胞中LysoTracker-Red (綠),Alexa 647-SWCNT(紅)和合并圖的共聚焦熒光成像;(b)沿合并圖像中虛線分布的兩個熒光圖熒光強度;(c)包含Alexa 647-SWCNT和不包含Alexa 647-SWCNT的輻射強度;(d)包含Alexa 488-AcLDL和不包含Alexa 488-AcLDL的U2OS-SRA細胞熒光成像;(e)感興趣區(qū)域的Alexa 488-AcLDL數量高光譜顯微鏡監(jiān)測溶酶體內腔脂質含量的變化為了測定脂質在溶酶體細胞內的積聚,作者先用U18666A或Lalistat 3a2對RAW 264.7巨噬細胞進行預處理,后與ss(GT)6-(8,6)復合物在37oC下培養(yǎng),以未經預處理的巨噬細胞作為空白對照。采用高光譜顯微鏡對上述三種細胞進行成像,與對照組相比,兩種經預處理之后的細胞發(fā)生了藍移,兩種細胞中都含有ss(GT)6-(8,6)復合物。核內質溶酶體脂質圖譜反映了ss(GT)6-(8,6)復合物對核內溶酶體腔內脂質積聚的光學響應,作者建立了一個關于CNTs發(fā)射峰值與脂質濃度之間的關系,對于U18666A處理過的細胞而言,NCP1蛋白的表達受到了阻礙,游離的膽固醇開始在溶酶體內腔積累,從而使得游離的膽固醇附著在ss(GT)6-(8,6)復合物的表面,導致CNTs發(fā)射峰藍移。同樣地,對于Lalistat 3a2處理過的細胞而言,更多游離的膽固醇脂附著在CNTs的表面,導致CNTs的發(fā)射波長發(fā)生藍移。因此,作者發(fā)現通過溶劑化變色作用,ss(GT)6-(8,6)復合物可以作為內溶酶體脂質含量變化的指示器(圖6)。


圖6:活細胞內溶酶體脂質積累的監(jiān)測;(a)ss(GT)6-(8,6)復合物在U18666A或Lalistat 3a2預處理過的巨噬細胞示意圖;(b)RAW 264.7巨噬細胞的高光譜圖像NCP1型成纖維細胞的脂質含量的測定及單細胞細胞器內脂質含量的量化作者評估了ss(GT)6-(8,6)復合物在NPC1型溶酶體脂質儲存障礙型疾病患者原代纖維細胞中的脂質積累變化的響應,高光譜數據表明,ss(GT)6-(8,6)在NPC1成纖維細胞中平均藍移6 nm,野生型成纖維細胞內溶酶體細胞器的脂質含量比較均勻,而NPC1細胞內的輻射分布較廣。為了測試ss(GT)6-(8,6)復合物的可逆性,作者用羥丙基β-環(huán)糊精對NPC1細胞進行處理,處理之后的高光譜圖像表明,來自先前藍移的NPC1細胞的報告基因發(fā)生了顯著的紅移。作者們還對該復合物進行了單細胞動力學測試,使用ACLDL和U18666A對細胞進行脂質積累誘導,并使用高光譜圖像檢測細胞內脂質含量的變化,研究表明,單個細胞的平均發(fā)射波長均發(fā)生藍移,并在90min達到平衡,細胞內脂質積累的時間常數平均約為40min,呈對數正態(tài)分布。在證明了ss(GT)6-(8,6)復合物可以在單細胞水平上可以監(jiān)測脂質的積累后,作者們還對該ss(GT)6-(8,6)復合物在細胞器水平上定量監(jiān)測脂質積累的能力進行了研究,采用高光譜圖像技術對骨髓來源的單核細胞向巨噬細胞轉化的過程中,溶酶體內單個細胞器脂質含量變化的差異性進行了監(jiān)測(圖7)。


圖7:定量測定單核細胞內溶酶體細胞器內脂質的差異性;(a)近紅外高光譜的寬場疊加圖像;(b)兩種細胞的內溶酶體脂質高光譜圖像;(c)ss(GT)6-(8,6)復合物在兩種細胞的發(fā)射像素點內的頻率分布直方圖概而論之,本工作作者們構建了一種溶酶體脂質通量變化的“光學報告器”,該“光學報告器”可以準確的定位在細胞的溶酶體內腔,而對細胞的正常生理過程沒有影響,借助于高光譜顯微鏡,可以繪制出細胞及細胞器內脂質含量的圖像。本工作作為shouci報道測量細胞內溶酶體脂質通量的文章,有望在未來脂質類藥物的篩選和脂質相關疾病的探索研究中發(fā)揮重大作用。


參考文獻
[1] Jena P V, Roxbury D, Galassi T V, etal. A carbon nanotube optical reporter maps endolysosomal lipid flux[J]. ACSNano, 2017 11(11) 10689-10703.

免責聲明

  • 凡本網注明“來源:化工儀器網”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網絡有限公司-化工儀器網合法擁有版權或有權使用的作品,未經本網授權不得轉載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經本網授權使用作品的,應在授權范圍內使用,并注明“來源:化工儀器網”。違反上述聲明者,本網將追究其相關法律責任。
  • 本網轉載并注明自其他來源(非化工儀器網)的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責,不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網站或個人從本網轉載時,必須保留本網注明的作品第一來源,并自負版權等法律責任。
  • 如涉及作品內容、版權等問題,請在作品發(fā)表之日起一周內與本網聯系,否則視為放棄相關權利。
企業(yè)未開通此功能
詳詢客服 : 0571-87858618
欧美日韩精品一区二区三区激情在线| 国产精品久久一二三区| 免费在线观看一本视频| 亚洲精品成人在线播放| 国产日韩欧美精品小视频| 久久久久久久久久久午夜福利| 国产成人亚洲综合91精品首页| 国产久久久久久久久一区二区| 欧美成人3p视频在线观看| 日韩一区二区三区久久久| 国产一级二级三级精品| 黑人操亚洲女一级黄色片| 国产一区二区日本在线观看| 成人在线三级黄色片| 国产人成尤物在线免费观看| 盗盗摄婷婷精品一区二区| 欧美日韩精品免费一级| 1024欧美一区二区三区人妻| 国产精品久久久久99999| 久久精一区二区三区| 午夜亚洲在在线观看| 激情小说校园春色亚洲| 中文国产成人AⅤ久久| 亚洲综合精品欧美日韩一区二区三区91| 中文字幕一区二区三区免费看| 国产资源网中文最新版| 国产AV无码亚洲一区二区| 国产在线观看视频一区| 欧美乱码精品一区二区三区卡| 国产在线一区二区三区欧美| 午夜福利国产观看视频1| 亚洲欧美日韩国产精品专区| 中文字幕亚洲日韩欧美色| 国产精品国语对白在线观看| 盗盗摄婷婷精品一区二区| 欧美亚洲综合中文字幕蜜桃成熟| 东北女人国语对白视频| 国产精品青青青高清在线观看| 日日摸夜夜摸狠狠摸婷婷| 人人妻人人澡av天堂香蕉| 亚洲国产成人精品女人久久0|