傷口愈合實(shí)驗(yàn)的這個(gè)關(guān)鍵步驟，你掌握了嗎？

傷口愈合實(shí)驗(yàn)是體外研究細(xì)胞遷移非常重要的實(shí)驗(yàn)。原理是人為的在鋪板的單層細(xì)胞中制造一個(gè)空白的無(wú)細(xì)胞的地帶，然后對(duì)這個(gè)無(wú)細(xì)胞地帶的邊緣的細(xì)胞進(jìn)行觀察；這些邊緣的細(xì)胞會(huì)開(kāi)始進(jìn)行遷移活動(dòng)，并且覆蓋整個(gè)無(wú)細(xì)胞的區(qū)域，重新互相接觸在一起。本研究中用到傷口愈合的實(shí)驗(yàn)，使用TARBP2和pri-miR130b共表達(dá)，通過(guò)對(duì)傷口愈合的速度的影響，得出TARBP2-K52R可以*抑制pri-miR130b對(duì)傷口愈合過(guò)程的影響。

在文中，使用Ibidi的傷口愈合插件進(jìn)行了傷口愈合實(shí)驗(yàn)。這是一種雙孔的硅膠插件，可以放在培養(yǎng)皿中，插件兩孔間的孔壁寬度為500μm。將細(xì)胞種在插件中，等待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，將插件移除，這樣，兩孔間的縫隙就是一個(gè)無(wú)細(xì)胞的500μm“劃痕”。

                圖1  使用ibidi Culture-Insert 2 Well進(jìn)行傷口愈合測(cè)定的實(shí)驗(yàn)工作流程

1.實(shí)驗(yàn)材料

1) 細(xì)胞:    serum starved A549luc stable cell line

2) 實(shí)驗(yàn)耗材:   傷口愈合插件培養(yǎng)皿 (ibidi, 81176)

3) 細(xì)胞培養(yǎng)基:  DMEM   （Hyclone）

4) 試劑:  Lipofectamine 2000 （Invitrogen）

5) 滅菌鑷子

6）倒置顯微鏡，最好具有自動(dòng)圖像采集系統(tǒng)和用于活細(xì)胞成像的頂部培養(yǎng)箱

2.實(shí)驗(yàn)步驟

步驟1：鋪細(xì)胞（圖二）

1.將ibidi傷口愈合培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶撕除。

2.在ibidi細(xì)胞插件的每孔中加入70μl 3x10 5的細(xì)胞懸液。注意不要大力晃動(dòng)培養(yǎng)皿。以防止細(xì)胞不均勻。

3.將細(xì)胞在37°C和5％CO2下孵育至少24小時(shí)

                  圖2   A. 去除培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶。B.C.在ibidi傷口愈合插件中加入細(xì)胞。

步驟2：形成“劃痕”

1.采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)

2.如圖三所示，小心的用鑷子夾住插件的一個(gè)角，將插件移除。

                                 圖3   使用無(wú)菌鑷子移除ibidi 插件

3.移除插件后，要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕”。

4.小心的用無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS清洗細(xì)胞，之后加入2ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

                           圖4   由ibidi插件移除產(chǎn)生無(wú)細(xì)胞500μm的縫隙

步驟3：采集顯微圖像分析

1.在顯微鏡下選取能同時(shí)看到“劃痕”和兩邊細(xì)胞的視野進(jìn)行成像，“劃痕”的方向比較好是水平或者垂直。

2.采集0h和10h的圖像，并且分析每張圖的細(xì)胞覆蓋劃痕區(qū)的面積。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖所示，共表達(dá)pri-miR130b和TARBP2-WT（miR130b-WT）比單獨(dú)表達(dá)pri-miR130b（miR130b-con）對(duì)細(xì)胞遷移更有抑制作用，而將pri-miR130b和TARBP2-K52R（miR130b-K52R）共表達(dá)對(duì)于細(xì)胞遷移基本沒(méi)有抑制作用了。