1. 背景

2. 材料與方法

2.1 病例

表1  患者和對(duì)照組的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床和血清學(xué)特征

2.2 方法

2.3分析評(píng)估

· 精密度研究

· 統(tǒng)計(jì)分析

3. 結(jié)果

3.1精密度測(cè)試

表2 根據(jù)CLSI EP15-A評(píng)價(jià)AQP4抗體ELISA檢測(cè)的精密度

3.2 AQP4抗體檢測(cè)

由ROC曲線確定臨界值為2.1U/mL，ELISA檢測(cè)AQP4抗體在NMO患者的靈敏度為83.3% (95% CI 62.6% ~ 95.2%)，特異性為100% (95% CI 87.1%-100%)，以及非常高的陽(yáng)性似然比(∞) 和陰性似然比(0.17)(表 3)。NMO患者的計(jì)算出的曲線下面積(AUC)的值為0.895 (95% CI 0.777-0.963) (圖2)。

圖2  a NMO患者AQP4自身抗體的(ROC)曲線分析。曲線下面積(AUC)是0.895。B LETM患者AQP4自身抗體檢測(cè)的ROC曲線分析。AUC是0.625。連續(xù)線為ELISA法；虛線表示95%的置信區(qū)間

表3 NMO和LETM患者的診斷靈敏度、特異性和似然比(陽(yáng)性似然比、陰性似然比)

在相同的臨界值下，LETM患者的靈敏度和特異性分別為25% (95% CI 9.8%-46.7%)和100% (95% CI 87.1%-100%)，陽(yáng)性似然比是∞，陰性似然比是0.75（表3）。

NMO患者與LETM患者AQP4抗體比例的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為83.3%和25%)( Fisher exact檢驗(yàn)，p = 0.0001)。

13例ON患者組均為AQP4抗體陰性，3例脊髓炎患者組除1例外其他2例為AQP4抗體陰性。所有對(duì)照均為AQP4抗體陰性。

間接免疫熒光法（IIF）與ELISA方法的結(jié)果*一致 (Cohen’s Kappa = 1.00)。

4. 討論

AQP4抗體是輔助診斷NMO患者的一個(gè)重要的工具，并已被納入該疾病的修訂診斷標(biāo)準(zhǔn)。最近，AQP4抗體也在單一橫貫脊髓炎患者、單一視神經(jīng)炎患者以及患有NMOSD并同時(shí)存在結(jié)締組織疾病的患者中被發(fā)現(xiàn)。因此，國(guó)際NMO診斷小組(IPND) 根據(jù)患者血清中AQP4抗體的存在，引入了新的命名法和新的診斷標(biāo)準(zhǔn)。新命名將所有與NMO相關(guān)的疾病統(tǒng)一為NMOSD，進(jìn)一步分為AQP4抗體陽(yáng)性的NMOSD、AQP4抗體陰性的NMOSD和AQP4抗體狀態(tài)不明的NMOSD。這些新標(biāo)準(zhǔn)使需要檢測(cè)水通道蛋白4抗體的臨床病例數(shù)量增加。

檢測(cè)AQP4抗體的重要性不僅因?yàn)镹MO與MS盡早和準(zhǔn)確的鑒別診斷，并且還因?yàn)閮烧咧委煵呗缘牟町?。諸如β-干擾素和醋酸格拉替雷(Copaxone)的免疫調(diào)節(jié)藥物被認(rèn)為是多發(fā)性硬化癥的第一選擇，免疫抑制藥物特別是B細(xì)胞靶向治療被認(rèn)為是治療NMO的有利因素。 

多種AQP4抗體的檢測(cè)方法已經(jīng)被研發(fā)。其中基于AQP4-M1異構(gòu)體的血清學(xué)檢測(cè)是首先被使用的方法。直到近些年，隨著OAPs被證明為是NMO-IgG主要的靶點(diǎn)，AQP4-M23才被越來(lái)越廣泛地用作靶點(diǎn)抗原。

Kim等使用內(nèi)部ELISA，同時(shí)檢測(cè)了兩種異構(gòu)體，在確診或高危NMO患者的檢出率方面，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體之間的任何差異，他們選擇使用M23異構(gòu)體，因?yàn)樗岣吡诵旁氡取Ｍ瑯拥?，Waters等通過(guò)商用CBA，在比較人類M1或M23異構(gòu)體時(shí)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)靈敏度的差異，但使用M23的信號(hào)增加。Mader使用活的人胚胎腎(HEK)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)M23異構(gòu)體的靈敏度更高。這些作者還觀察到兩種方法中不同的染色模式。與M23異構(gòu)體相比，與M1異構(gòu)體結(jié)合的抗體顯示出更小的染色斑點(diǎn)，這支持了之前的數(shù)據(jù)，M23異構(gòu)體在HEK細(xì)胞中形成OAP。

此外，使用NMO患者的血清和重組AQP4特異性單克隆抗體，Crane等發(fā)現(xiàn)，由于OAP結(jié)構(gòu)的原因，M23比M1在AQP4-IgG單克隆抗體或其Fab片段上顯示出具有持續(xù)的更高的親和力，這再次表明AQP4異構(gòu)體的選擇以及OAP的結(jié)構(gòu)可以直接影響檢測(cè)靈敏度。

本研究的目的是評(píng)價(jià)一種新的商用M23抗原ELISA檢測(cè)AQP4抗體的性能。結(jié)果與間接免疫熒光法商用IIF產(chǎn)品的結(jié)果進(jìn)行比較。雖然沒(méi)有直接與使用M1-AQP4的ELISA進(jìn)行比較，但我們的數(shù)據(jù)顯示，靈敏度(83.3%) 高于之前使用M1異構(gòu)體的研究報(bào)告，與CBA獲得的平均靈敏度相似(76.7%；范圍55.6-96.7%)，顯著高于其他方法(范圍48.5-62.3%)。

最后，ELISA檢測(cè)結(jié)果與目前檢測(cè)AQP4抗體的參考方法（間接免疫熒光法IIF）檢測(cè)結(jié)果一致(100%一致)。

我們的研究也旨在評(píng)價(jià)這種新的AQP4 抗體ELISA分析方法的準(zhǔn)確性。它的重要性在于，因?yàn)橐恍┓椒ㄔ诓煌膶?shí)驗(yàn)室應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生了不一致的結(jié)果，同一樣品在不同的檢測(cè)方法中檢測(cè)出不一致的結(jié)果。然而，結(jié)果可重復(fù)的AQP4抗體檢測(cè)對(duì)于大型多中心研究來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，這些研究旨在更好地確定NMO患者的流行病學(xué)、臨床和病理特征以及他們對(duì)治療的反應(yīng)。

我們發(fā)現(xiàn)，使用兩種不同抗體濃度檢測(cè)批內(nèi)、不同日間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以CV表示的精密度變異系數(shù)低，在對(duì)低濃度和高濃度AQP4抗體的陽(yáng)性對(duì)照上測(cè)量的總重復(fù)性甚至比相同濃度水平下制造商所聲稱的更好。

該檢測(cè)具有良好的分析精密度和準(zhǔn)確度，以及在全自動(dòng)系統(tǒng)上體現(xiàn)的相對(duì)易用和快速響應(yīng)的的特性，證明該檢測(cè)對(duì)于適用于日常檢測(cè)，并可能適合用于AQP4抗體的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。

本研究的進(jìn)步意義體現(xiàn)在兩個(gè)重要方面。一方面是可以使各家實(shí)驗(yàn)室獲得簡(jiǎn)單易用的AQP4抗體定量方法，另一方面是這款新的ELISA方法在特異性與靈敏度上的良好表現(xiàn)，其性能與當(dāng)下的金標(biāo)準(zhǔn)CBA方法一致。

本研究初次評(píng)價(jià)了一種新型的商用ELISA檢測(cè)AQP4抗體的方法，是一種有效的CBA替代方法。我們相信，我們的發(fā)現(xiàn)可以為輔助AQP4抗體檢測(cè)奠定基礎(chǔ)，從而促進(jìn)對(duì)NMOSD病人更早、更準(zhǔn)確的診斷。

 原文標(biāo)題：

A new M23-based ELISA assay for anti-aquaporin 4 autoantibodies: diagnostic accuracy and clinical correlation