心血管系統(tǒng)不斷地暴露在由血流和壓力決定的各種機械力之下。有充分證據(jù)表明,血壓升高(高血壓)會導(dǎo)致血管重塑。血管壁介質(zhì)中的血管平滑肌細胞 (VSMCs) 是維持血管穩(wěn)態(tài)所必需的,在體內(nèi)受到機械循環(huán)拉伸。隨著病理性拉伸的增加,VSMCs從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚停涮卣魇窃鲋澈瓦w移活動增加,收縮性喪失,細胞外基質(zhì)產(chǎn)生異常。然而,機械循環(huán)拉伸調(diào)節(jié) VSMCs 功能的分子機制仍有待進一步闡明。
DKK1 (dickkopf-1) 是 Dickkopf 家族中研究的最深入的分泌蛋白。越來越多的研究表明,DKK1具有腫瘤促進作用。近年來,DKK1也被確立為心血管疾病的新媒介。此外,DKK1 也可作為預(yù)測急性缺血性中風(fēng)和急性冠狀動脈綜合征患者臨床結(jié)果的潛在生物標志物。其他一些先前的研究表明, DKK1 在調(diào)節(jié)人類血管平滑肌細胞的功能中的作用相互矛盾。因此,探尋 DKK1 在VSMCs 中的作用相關(guān)的分子信號通路仍然是一個關(guān)鍵的挑戰(zhàn)。
由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、心血管重塑與功能研究教育部重點實驗室等單位的專家學(xué)者先前已經(jīng)證明,DKK1參與了動脈粥樣硬化的發(fā)展。靶向DKK1療法可能不僅有抗腫瘤作用,而且對心血管疾病也有保護作用,一舉兩得。因此,揭示DKK1在心血管疾病發(fā)展中的作用,對于指導(dǎo)針對DKK1的抗腫瘤藥物在心血管疾病患者腫瘤中的應(yīng)用具有重要意義。
該團隊已經(jīng)證實,DKK1在內(nèi)皮細胞中的表達在體內(nèi)擾動流和體外振蕩剪切應(yīng)力 (OSS) 處理下上調(diào)。DKK1 的敲低減弱了OSS 誘導(dǎo)的單核細胞粘附和內(nèi)皮損傷。目前尚不清楚 DKK1 是否通過機械拉伸調(diào)節(jié)平滑肌細胞的功能。
因此,該團隊進行了深入研究,于 International Journal of Biological Sciences 上聯(lián)合發(fā)表了題為《Dickkopf-1 promotes Vascular Smooth Muscle Cell proliferation and migration through upregulating UHRF1 during Cyclic Stretch application》的研究成果。在這項研究中,以人主動脈平滑肌細胞 (HASMCs) 和小鼠為實驗對象,探討了 DKK1 在病理牽張條件下動脈重塑發(fā)展中的作用及其機制。
實驗結(jié)果:
機械過度拉伸增加了 VSMCs 中 DKK1 的表達
腹主動脈縮窄 (AAC) 小鼠的收縮壓 (SBP) 和舒張壓 (DBP) 顯著高于假手術(shù)對照組小鼠。在手術(shù)后1 周,與假手術(shù)對照組小鼠相比,AAC 小鼠的胸主動脈和冠狀動脈中膜中檢測到 DKK1 蛋白水平顯著增加。取胸主動脈并通過蛋白質(zhì)印跡分析,在AAC小鼠中DKK1的相對蛋白表達水平顯著增加。通過ELISA測定小鼠血清中的DKK1水平,兩組之間未觀察到血清DKK1 水平的差異。
對人 VSMCs 進行了進一步的體外實驗,以驗證 DKK1 響應(yīng)高水平拉伸的變化。使用循環(huán)拉伸加載系統(tǒng),對 HASMCs 進行不同時間長度(0、3、6、12 或 24 小時)的高強度拉伸(18%),HASMCs 和培養(yǎng)上清液都表現(xiàn)出 DKK1 蛋白水平隨時間依賴性增加,而當細胞處于5% 循環(huán)拉伸時沒有觀察到變化。將HASMCs 在無拉伸、正常拉伸 (5%) 或高強度拉伸 (18%) 的情況下處理 6 小時,然后收集細胞裂解物用于蛋白質(zhì)印跡分析。DKK1 表達在高水平拉伸處理的細胞中顯著高。
DKK1 有助于在機械拉伸下調(diào)節(jié) VSMC 功能
DKK1 在調(diào)節(jié) VSMC 功能調(diào)控中的作用目前尚不清楚。實驗通過針對DKK1 的小干擾 RNA (siRNA) 轉(zhuǎn)染到細胞中來降低 VSMCs 中 DKK1 的蛋白質(zhì)表達。與用干擾siRNA轉(zhuǎn)染相比,用DKK1-siRNA 轉(zhuǎn)染 24 小時有效地抑制了 DKK1 mRNA 水平。
在用 DKK1-siRNA 或干擾 siRNA 轉(zhuǎn)染后,HASMCs 用 5% 或 18% 的拉伸刺激 24 小時,然后進行 EdU 和 CCK-8 檢測細胞增殖,Transwell 檢測細胞遷移。EdU 和 CCK-8 檢測表明,18% 的循環(huán)拉伸顯著促進了 HASMCs 的增殖,而敲低 DKK1 抑制了這種作用。Transwell 測定結(jié)果表明,DKK1-siRNA 組中遷移到下腔室的細胞數(shù)量顯著低于對照組 。
通過WB法分析全細胞裂解物的增殖標記物PCNA和收縮表型標記物α-SMA的蛋白質(zhì)水平。與正常拉伸(5%)處理相比,高水平拉伸(18%)上調(diào)了PCNA 的蛋白質(zhì)水平并下調(diào)了 α-SMA 的蛋白質(zhì)水平。通過敲低 DKK1 的表達,這些變化被部分逆轉(zhuǎn)。外源性rhDKK1的添加促進了細胞增殖和遷移,促進了PCNA的表達并抑制了α-SMA的表達。
DKK1 通過靶向 UHRF1 參與調(diào)控 HASMC 功能
考慮到 DKK1 被稱為典型 Wnt 信號通路的拮抗劑,研究人員進行了實驗以確定在循環(huán)拉伸應(yīng)用過程中,典型的Wnt通路是否參與了DKK1在HASMC 中的作用。
在差異表達的基因中,重點研究了一個特定的基因,UHRF1。最近的研究結(jié)果表明,UHRF1 可能在調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞的增殖、遷移和表型方面發(fā)揮重要作用。實驗驗證了在高水平拉伸下UHRF1的蛋白質(zhì)水平顯著增加,而在正常條件下沒有檢測到變化。當 DKK1 在高水平拉伸下被 siRNA 敲低時,UHRF1 表達在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上顯著下調(diào)。此外,rhDKK1 的刺激顯著增加了 HASMCs 中 UHRF1 的表達。
為了進一步研究 UHRF1 是否介導(dǎo) DKK1 對 HASMCs 的影響,用 siRNA 敲低 UHRF1 48 小時,并在 rhDKK1 刺激的情況下用正常 (5%) 或高水平拉伸 (18%) 處理細胞 24 小時。然后通過EdU 和 CCK-8 分析評估細胞增殖,Transwell 分析評估細胞遷移, qRT-PCR 評估 RNA 的干擾效率。在 rhDKK1 刺激的 HASMCs 中,敲低 UHRF1 顯著減弱了細胞增殖和遷移的增加。同樣,蛋白質(zhì)印跡分析表明,敲低 UHRF1 后,PCNA 的蛋白水平顯著降低,α-SMA 的蛋白水平升高。
此外,實驗還證實小鼠平滑肌 (SM) 特異性 DKK1 缺失可改善血管重塑,說明DKK1 參與了由高水平拉伸引起的血管重塑和 VSMC 功能的改變;并且DKK1 是通過 YAP-TEAD 通路調(diào)節(jié)UHRF1。
實驗結(jié)論:
在這里,實驗證明 DKK1 是機械拉伸誘導(dǎo)的 VSMC 表型轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵介質(zhì)。數(shù)據(jù)表明,高水平的拉伸可在體內(nèi)和體外誘導(dǎo) DKK1 的表達。在體內(nèi),實驗發(fā)現(xiàn) SMCs 中DKK1 基因的缺失減輕了 AAC 誘導(dǎo)的血管重塑。在體外,機械拉伸誘導(dǎo)的DKK1 通過YAP-TEAD 通路上調(diào) UHRF1,并導(dǎo)致 VSMC 增殖和遷移的增強。
總之,該研究表明,DKK1 通過 YAP-TEAD 通路調(diào)節(jié) UHRF1 表達,從而介導(dǎo)平滑肌細胞功能的機械拉伸調(diào)控。
參考文獻:Zheng TF, Liu XL, Li X, Wang QQ, Zhao YC, Li X, Li MM, Zhang Y, Zhang M, Zhang WC, Zhang C, Zhang Y, Zhang M. Dickkopf-1 promotes Vascular Smooth Muscle Cell proliferation and migration through upregulating UHRF1 during Cyclic Stretch application. Int J Biol Sci. 2021 Mar 21;17(5):1234-1249. doi: 10.7150/ijbs.56247. PMID: 33867842; PMCID: PMC8040467.
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