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剪切應(yīng)力通過降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的質(zhì)膜膽固醇來激活線粒體氧化磷酸化
迄今為止，許多研究闡明了 EC 機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制，并揭示了一個(gè)*的特征：剪切應(yīng)力幾乎同時(shí)通過離子通道、受體和粘附蛋白等多種膜分子激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。近年來，質(zhì)膜本身在EC機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用。EC質(zhì)膜通過改變其物理性質(zhì)（如流動(dòng)性、粘度和脂質(zhì)順序）來快速響應(yīng)剪切應(yīng)力。
已知Ca 2+信號(hào)在 EC 機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ECs快速釋放內(nèi)源性三磷酸腺苷(ATP)以響應(yīng)剪切應(yīng)力，該ATP激活位于質(zhì)膜上的嘌呤受體，這些嘌呤受體負(fù)責(zé)細(xì)胞外 Ca 2+流入和 Ca 2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放。細(xì)胞質(zhì) Ca 2+的增加激活了多種 EC 功能。
膽固醇通過影響膜脂順序、流動(dòng)性、彎曲系數(shù)、厚度、硬度和雙層壓力分布，在決定質(zhì)膜的機(jī)械性能方面起主導(dǎo)作用。例如，EC 質(zhì)膜膽固醇的消耗會(huì)抑制剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的激活，而向 EC 質(zhì)膜添加膽固醇可抑制剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 VEGFRs 磷酸化。然而，質(zhì)膜膽固醇在 EC 機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用尚未*闡明，部分原因是缺乏關(guān)于質(zhì)膜膽固醇在EC剪切應(yīng)力下表現(xiàn)的信息。
來自東京大學(xué)研究生院生物醫(yī)學(xué)工程系的專家團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了更深層次的研究，在 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 上發(fā)表了題為《Shear stress activates mitochondrial oxidative phosphorylation by reducing plasma membrane cholesterol in vascular endothelial cells》的研究論文。
該團(tuán)隊(duì)以往的研究表明，線粒體在 ECs中剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 ATP 釋放和 Ca 2+信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。在剪切應(yīng)力刺激下，ECs 迅速增加線粒體 ATP 的產(chǎn)生，觸發(fā) ATP 釋放和隨后的 Ca 2+信號(hào)傳導(dǎo)。然而，作用于質(zhì)膜的剪切應(yīng)力影響 ECs 中線粒體氧化磷酸化的方式仍然未知。
在本研究中，對(duì)培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HPAECs)施加控制水平的剪切應(yīng)力，并使用基于 D4 突變體的膽固醇生物傳感器的熒光成像和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)質(zhì)膜膽固醇的數(shù)量和分布的變化。
實(shí)驗(yàn)還使用生化測(cè)量來分析整個(gè)細(xì)胞和分離的質(zhì)膜中膽固醇含量的變化。此外，為了確定質(zhì)膜膽固醇的變化是否影響線粒體氧化磷酸化，利用基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的ATP生物傳感器實(shí)時(shí)成像，檢測(cè)了線粒體ATP濃度的變化。
部分實(shí)驗(yàn)過程
1.剪切應(yīng)力導(dǎo)致質(zhì)膜膽固醇的快速下降
當(dāng)HPAECs在流體加載裝置中承受15 dynes/cm2的剪應(yīng)力15 min時(shí)，定位于質(zhì)膜的EGFP-D4YDA和mCherry-D4YDA信號(hào)均顯著下降（圖1 A）。定量分析表明，剪切應(yīng)力顯著降低了質(zhì)膜中兩種探針的熒光強(qiáng)度。這些發(fā)現(xiàn)表明，剪切應(yīng)力降低了定位于內(nèi)外質(zhì)膜雙分子層的膽固醇含量。
圖一
當(dāng)剪切應(yīng)力停止5分鐘后，在mCherry-D4YDA圖像中看到的下降的膽固醇水平回到了控制水平（圖1 B）。mCherry-D4YDA實(shí)時(shí)成像顯示，剪切應(yīng)力開始后，內(nèi)質(zhì)膜膽固醇水平立即開始下降，剪切應(yīng)力停止后，下降的膽固醇水平逐漸恢復(fù)（圖1 C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，膜膽固醇的反應(yīng)是快速且可逆的。
用 EGFP-D4 YDA 標(biāo)記的HPAEC進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)以量化其質(zhì)膜外雙分子層的膽固醇含量（圖1 D）。膽固醇水平在剪切應(yīng)力開始后迅速下降，在 10 分鐘時(shí)達(dá)到最小值（約為靜態(tài)控制值的60%），此后趨于穩(wěn)定。剪切應(yīng)力停止后，降低的膽固醇水平恢復(fù)到控制水平。
當(dāng) ECs 受到不同強(qiáng)度的剪切應(yīng)力時(shí)，膽固醇水平在 0 到 10 dynes/cm2范圍內(nèi)以劑量依賴的方式下降；在10 dynes/cm2達(dá)到最小值后，它們保持在 15 dynes/cm2的相同水平（圖 1 E）。用膽固醇消耗劑 MβCD 處理細(xì)胞后，質(zhì)膜膽固醇水平降低到對(duì)照組的一半以下(圖1 E)。
在流動(dòng)加載實(shí)驗(yàn)中，ECs不僅受到剪切應(yīng)力，而且還受到對(duì)細(xì)胞膜施加的壓力。為了確定壓力是否影響膜膽固醇水平，EC 在無流動(dòng)條件下承受靜水壓力 (40 mm Hg)。結(jié)果顯示，單獨(dú)的靜水壓力對(duì)膜膽固醇水平?jīng)]有影響（圖1 E）。這意味著流動(dòng)誘導(dǎo)的質(zhì)膜膽固醇降低歸因于剪切應(yīng)力而不是壓力。
2.剪切應(yīng)力主要是在頂端質(zhì)膜中降低了游離膽固醇和酯化膽固醇
從 HPAEC 中分別獲得頂端和基底質(zhì)膜，并通過生化方法測(cè)量每個(gè)膜中的膽固醇含量。15 dynes/cm2剪應(yīng)力作用15 min后，頂端質(zhì)膜的膽固醇含量顯著下降，但基底質(zhì)膜的膽固醇含量無明顯下降（圖2 A）。這說明質(zhì)膜膽固醇的降低主要發(fā)生在頂膜。
圖二
質(zhì)膜不僅含有游離膽固醇，還含有酯化膽固醇。在用或不用酯酶處理的 ECs 的生化分析中量化游離和酯化膽固醇的量。在質(zhì)膜中，酯化膽固醇的量約為游離膽固醇的四分之一。在剪切應(yīng)力刺激下，頂端質(zhì)膜中的酯化膽固醇和游離膽固醇顯著降低（圖2 A）。
為了檢查膽固醇在剪切應(yīng)力下離開質(zhì)膜的目的地，使用在靜態(tài)條件下培養(yǎng)或受到 15 dynes/cm2剪切應(yīng)力的 HPAEC 對(duì)整個(gè)細(xì)胞和分離的質(zhì)膜中的游離膽固醇量進(jìn)行了生化測(cè)定。 在剪切應(yīng)力刺激 15 分鐘后，整個(gè)細(xì)胞中的游離膽固醇水平下降到對(duì)照組觀察到的 80% 左右，而在分離的質(zhì)膜中，這一比例下降到對(duì)照組的64%左右（圖2 B）。這些發(fā)現(xiàn)表明，離開質(zhì)膜的大部分膽固醇移出細(xì)胞，而剩余的則進(jìn)入細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
D4 成像和流式細(xì)胞術(shù)顯示剪切應(yīng)力顯著降低了 HPAECs 中的質(zhì)膜膽固醇，這與膽固醇的生化測(cè)量結(jié)果一致。質(zhì)膜膽固醇的下降主要發(fā)生在頂端質(zhì)膜，且呈剪應(yīng)力依賴性和可逆性。雖然剪應(yīng)力降低質(zhì)膜膽固醇水平的機(jī)制尚不清楚，但可能與水以脂質(zhì)順序依賴的方式進(jìn)入質(zhì)膜有關(guān)。
之前使用Laurdan熒光成像的研究顯示，在剪切應(yīng)力的作用下，隨著質(zhì)膜脂質(zhì)順序的降低，進(jìn)入脂質(zhì)雙分子層的水量增加，從而為疏水性膽固醇離開質(zhì)膜提供了合適的條件?？傊?，研究表明，質(zhì)膜膽固醇動(dòng)力學(xué)在HPAEC對(duì)剪切應(yīng)力的反應(yīng)中起重要作用。
參考文獻(xiàn)：Yamamoto K, Nogimori Y, Imamura H, Ando J. Shear stress activates mitochondrial oxidative phosphorylation by reducing plasma membrane cholesterol in vascular endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Dec 29;117(52):33660-33667. doi: 10.1073/pnas.2014029117. Epub 2020 Dec 14. PMID: 33318210; PMCID: PMC7776821.
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