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測量時樣品一般使用血清或者血漿，但是這種樣品對研究應激的實驗來說卻存在許多問題，例如：取樣過程中的捕捉、麻醉、取樣前是否進食、取樣前短時間內環(huán)境變化引起的躁動及皮質醇的晝夜節(jié)律變化都會對動物的應激實驗造成干擾。
在動作敏捷、個體較大的群養(yǎng)動物應激研究中，問題更為突出：如多次采血帶來的動物福利問題；由于不能在短時間內捕捉到動物，捕捉時目標動物和同籠的其他動物所受到的應激影響；多次重復捕捉給動物帶來的影響。這些問題都可能會影響應激相關研究實驗數(shù)據(jù)的可信性，阻礙了個體較大的群養(yǎng)動物（如獼猴——一種非常好的人類疾病研究模型）的應激研究。因此，取樣技術的選擇在應激研究中顯得尤其重要。
為了避免這些問題，毛發(fā)樣品是一種很好的選擇，血液里的物質可以通過毛細血管滲透到毛囊細胞，后擴散到毛發(fā)里。因此，從毛發(fā)中可以提取出皮質醇。
1、毛發(fā)提取過程
樣品粉碎是提取毛發(fā)皮質醇非常關鍵的一步，從相關文獻中可以發(fā)現(xiàn)Davenport等對這一步驟的改進：起初為剪碎，后來使用了德國萊馳MM200 進行研磨粉碎。我們使用了德國萊馳MM400，并在文獻基礎上做了一定改進：將樣品放入液氮內充分冷凍變脆后，再進行研磨，這樣既可以使研磨粉末更細、更均勻，又可以避免研磨過程中局部高溫對樣品造成的影響。
終用甲醇進行提取。
具體操作步驟：
（1）稱取 500 mg毛發(fā)樣品置于 15 mL玻璃試管中，加入10 mL異丙醇。在室溫下將該試管放于調速多用振蕩器上洗滌 3 min（頻率 100 次/min），共洗滌 2 次；洗滌后的樣品置于電熱恒溫干燥箱內，37℃干燥 8 h。
（2）干燥后將樣品放入 80 mL小燒杯內，用手術剪剪碎。之后放入 25 mL不銹鋼研磨罐內（內有 15 mm不銹鋼研磨球一個），擰緊后將罐放入液氮內冷凍至液氮停止沸騰。將研磨罐裝入冷凍混合型球磨儀MM400，研磨 2.5 min（頻率 26 Hz）。
（3）稱取400 mg毛發(fā)粉末a，置于 10 mL離心管內，并加入 8 mL甲醇。室溫下，將離心管置于振蕩器，振蕩 24 h（頻率 230 次/min），提取皮質醇。
（4）將離心管離心 5 min（離心力 12 000 g,），取 4 mL上清液移入 5 mL離心管內。
（5）在 5 mL離心管內取 2 mL上清液放入2 mL離心管，室溫用氮氣流進行干燥，樣品干燥后，加入 5 mL離心管內的剩余樣品，繼續(xù)干燥（隨著甲醇的揮發(fā)，離心管內出現(xiàn)懸浮物。我們對這些懸浮物進行了研究）。
（6）干燥后加入 0.5 mL PBS (磷酸緩沖液：NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2 HPO4 1.44 g, KH2 PO4 0.24 g，加去離子水定容至 1 L，將pH值調整到7.4)對樣品進行重構。振蕩混勻后，放入−20℃冰箱內儲存至檢測日。
2、實驗設計
(1)為排除離心管和 PBS (磷酸緩沖液)帶來的假陽性，我們將 0.5 mLPBS 放入離心管進行了放免檢測(n=3)。
(2)離心管壁可能會吸附皮質醇，對皮質醇濃度測量造成影響，為檢測這種影響，我們將重構后的樣品的 1/2 移入新管，如果有吸附作用，則新管(n=10)中樣品由于經過了兩次吸附，皮質醇濃度應低于原管(n=10)。
(3)為了檢驗懸浮物對測量結果是否有影響，我們對同一樣品的濁液(n=10)和清液(n=10)進行了比較。
(4)為了保證實驗操作的可靠性，我們對其中一批樣品(n=16)在不同時間進行了兩次放免測量。對同一只動物(n=16)的兩個樣品，不同時間做了同樣的處理。(5)為了證明毛發(fā)中的皮質醇可以反映動物受到的應激大小，我們對毛發(fā)中的皮質醇濃度與動物受到的攻擊量(n=16)進行了相關分析。
3、實驗結果
4、討 論
整個提取過程中，離心管和 PBS 并沒有對樣品造成假陽性。這說明樣品皮質醇來源于毛發(fā)，而不是污染。離心管壁沒有吸附皮質醇，因此不會對數(shù)據(jù)的可靠性造成影響。重構后樣品是一種濁液，難以分離，不過我們實驗證明樣品里的懸浮物對結果不會造成影響，不需要分離。然而，我們建議檢測前將樣品混勻。同一樣品兩次測量的結果，其高度相關性表明了放免檢測操作過程穩(wěn)定，重復性好，測量結果可信。同一動物兩個樣品間的高度相關性為我們整個實驗操作的可靠性提供了證據(jù)，同時也說明同一動物鄰近毛發(fā)的皮質醇含量高度相關。受到的攻擊量雖然是血漿中皮質醇濃度的間接指標，但是它與毛發(fā)皮質醇濃度的中度相關性，以及我們實驗數(shù)據(jù)與文獻數(shù)據(jù)皮質醇含量范圍的一致性(Davenport et al，2006)，都說明了我們確實提取到了毛發(fā)中的皮質醇，數(shù)據(jù)可信，同時毛發(fā)皮質醇可以作為衡量應激刺激大小的指標。由我們的經驗及測量得到的樣品皮質醇含量低值和試劑盒的靈敏度大致可以推算出：在獼猴毛發(fā)皮質醇提取實驗中，為得到足夠濃度，毛發(fā)樣品量不宜低于 200 mg。
總結：毛發(fā)皮質醇濃度可以作為衡量慢性應激刺激大小的指標。
文中使用的研磨設備——
德國RETSCH(萊馳)冷凍混合球磨儀MM400
冷凍混合型球磨儀MM400是一臺臺式多功能儀器。它主要運用于小量樣品的干磨、濕磨以及低溫研磨。
它能在幾秒鐘內就可以達到混合、均化粉末和懸浮物的目的。此外，混合型球磨儀還特別適合用于生物細胞破壁以及DNA/RNA的收集。MM400以其*的性能和高超的靈活度而成為實驗室的*的儀器。
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