水質(zhì)  蛔蟲卵的測定  沉淀集卵法

蛔蟲卵測定適用范圍：

本標準規(guī)定了測定水中蛔蟲卵的沉淀集卵法。 

本校準適用于地表水和廢水中的蛔蟲卵測定。

當取樣體積為10L時，本方法的檢出限為5個/10L（注：不銹鋼開口直壁容器應(yīng)選擇10L帶刻度）

規(guī)范性引用文件

本標準內(nèi)容引用了下列文件或其中的條款。凡是不注明日期的引用文件，其有效版本適用于本標準。

HJ/T 91地表水和污水檢測技術(shù)規(guī)范

方法原理：

沉淀集卵法主要通過樣品的濃縮、雜質(zhì)分離、鏡檢計數(shù)等環(huán)節(jié)對水中的蛔蟲卵進行測定。用60目全不銹鋼篩網(wǎng)過濾去除樣品中交大的雜質(zhì)，利用蛔蟲卵比重大于水和易于沉淀的特性過夜沉淀濃縮水樣，用虹吸的放大棄去上清液，用表面活性劑吐溫80作為殘液及沉淀轉(zhuǎn)移時的清洗劑，進一步離心濃縮轉(zhuǎn)移的剩余物，收集到的濃縮物用乙酸-乙酸鈉緩沖液混勻，控制溶液PH值，獲得親水-親脂平衡，加入乙酸乙酯吸收水中的脂肪類雜質(zhì)，使蛔蟲卵更容易下沉。再次離心濃縮樣品并棄去上部脂肪雜質(zhì)層級緩沖液層，獲得的含卵沉淀層用飽和硝酸鈉溶液混勻，于計數(shù)框中靜置漂浮后鏡檢，即可測得水樣中蛔蟲卵的數(shù)量。

配套試劑和材料：

      分析時請使用符合國家標準的分析純化學(xué)試劑，試驗用水為新制備的蒸餾水或者去離子水。

一：乙酸乙酯（C4H8O2）       

二：乙酸-乙酸鈉緩沖液：PH=4.5

稱取15.0g三水合乙酸鈉(CH3COONa3H2O) ，溶于約800 ml實驗用水中，加入3.6 ml乙酸(CH;COOH)調(diào)節(jié)pH值至4.5， 用實驗用水定容至1000 ml。此溶液保質(zhì)期為30d。

三：吐溫80溶液: q (C24H4O6) =1 %o。

      移取1ml吐溫80(Tween80)，用實驗用水稀釋定容至1000ml,臨用現(xiàn)配。

四：飽和硝酸鈉(NaNO3) 溶液

      稱取略多于實驗環(huán)境溫度對應(yīng)溶解度的硝酸鈉(NaNO3),充分溶解于100g實驗用水中，用濾紙濾去殘渣，臨用現(xiàn)配。硝酸鈉在不同溫度下的溶解度見附錄A。

配套儀器和耗材：

      分析時如有量器請使用符合國家標準的A級量器

一：顯微鏡：物鏡4x、10倍，目鏡10x倍

二：冰箱：0℃-4℃

三：水平轉(zhuǎn)子離心機：帶50ml螺口尖底離心管，離心力1000g以上

四：漩渦混合器

五：篩網(wǎng)：60目 ，孔徑250um 

六：不銹鋼開口直壁容器10L（帶刻度

七：開口直壁量筒：1000ml   A級

八：虹吸管

九：洗瓶

十：螺口尖底離心管50ml

十一：一次性巴氏滴管3ml、10ml

十二：微移液器：1000ul

十三：定量計數(shù)框：1ml網(wǎng)格、5ml型

樣品：

按HJ/T 91中對一般污染物采樣的要求，用10 L以上容積的塑料桶采樣。采樣前需用樣品蕩洗塑料桶，采集樣品量應(yīng)≥10L,常溫下運回實驗室，立即進行過濾(7.1)和沉淀(7.2)。

分析步驟：

一：過濾

      充分搖勻樣品，轉(zhuǎn)入不銹鋼開口直壁容器至10L刻度。如樣品中含有草梗、紙渣等較大雜質(zhì)，需將樣品用篩網(wǎng)過濾，并用吐溫80溶液清洗篩網(wǎng)及雜質(zhì)，洗液并入過濾后的10L樣品中。

二：沉淀

      上述樣品在15 C~25 C室溫下靜置過夜沉淀12 h~24 h,用虹吸管小心吸取并棄去上清液，避免擾動，保留1 L含沉淀物的樣品，轉(zhuǎn)入1000 ml開口直壁量筒，分別用50 ml吐溫80溶液*清洗不銹鋼開口直壁容器3次，洗液并入開口直壁量筒。在15 C~25 C室溫下再次靜置過夜沉淀12h~24h,用虹吸管吸取并棄去上清液，避免擾動，保留90 ml~ 100 ml含沉淀物的樣品。

      注1:若樣品中蛔蟲卵濃度在10倍檢出限以上(>50個/10L),采樣時，可只采總量不小于1L的樣品，取1L水樣直接進行第二步的量筒沉淀濃縮。當樣品中含有草梗、紙渣等較大雜質(zhì)，同樣應(yīng)先將樣品用篩網(wǎng)過濾，并用吐溫80溶液清洗篩網(wǎng)及雜質(zhì)，洗液并入1 L樣品中沉淀。

離心：

沉淀濃縮后的樣品(7.2) 小心轉(zhuǎn)移至3個螺口尖底離心管，分別用15 ml 吐溫80溶液*清洗開口直壁量筒3次，洗液均勻并入3個螺口尖底離心管。以1000g 的離心力(離心機轉(zhuǎn)速計算見附錄A)離心15 min,用巴氏滴管小心吸取并棄去，上清液，少量留之，避免帶出沉淀。

      用少量吐溫80溶液將3個離心管中的沉淀進行懸浮，將沉淀量少的2個離心管中的懸浮液并入沉淀量多的一個離心管中:分別用3 ml~ 5 ml吐溫80溶液*清洗被轉(zhuǎn)移懸浮液的2個離心管，每支清洗3次，確保沒有沉淀被丟棄，洗液并入沉淀量多的離心管。以1000g的離心力離心15min, 用巴氏滴管小心吸取并棄去上清液，少量留之，避免帶出沉淀。

脂類雜質(zhì)分離去除：

用與離心后沉淀等體積的乙酸-乙酸鈉緩沖液對沉淀進行懸浮(即:離心后沉淀體積為2 ml,加入2ml緩沖液。如果離心后沉淀體積不足2ml,加入緩沖液至4 ml。以確保用乙酸乙酯浸提后，沉淀上方有足夠體積的緩沖液，便于脂類雜質(zhì)層*傾出，且避免蛔蟲卵沉淀層的丟失。

      加入2倍離心后沉淀體積的乙酸乙酯，用渦旋混勻器*混合。以.1000g的離心力離心15 min， 樣品被分為清晰的三層。所有的非脂肪物質(zhì)、重碎片，包括蛔蟲卵、幼蟲和原生動物在底層;中間層是緩沖液層;脂肪和其他脂溶性物質(zhì)在上方形成黑而厚的一層。

      將上層和中間層液體平穩(wěn)傾出棄去，記錄底層沉淀體積。如有必要，可用細針在離心管壁四周對上層的脂肪層進行松動。

鏡檢：

加入5倍底層沉淀(7.4)體積的飽和硝酸鈉溶液，對分離去除脂類雜質(zhì)后的含卵底層沉淀進行懸浮。該懸浮液可置于0 C~4 C冰箱冷藏保存，備檢，于1周內(nèi)檢測完畢，檢測時需將其靜置至室溫。充分搖勻懸浮液，將其轉(zhuǎn)入定量計數(shù)框靜置5 min,在顯微鏡下計數(shù)，直至全部懸浮液鏡檢完成。分別用1 ml飽和硝酸鈉溶液充分洗滌鏡檢完的離心管3次，將洗液轉(zhuǎn)入定量計數(shù)框，按以上步驟鏡檢。所有檢測到的蛔蟲卵全部計數(shù)。

      鏡檢時，需保持環(huán)境條件的穩(wěn)定，無震動和風(fēng)擾，緩移計數(shù)框，自上而下“U”型逐列計數(shù)?；紫x卵鑒定方法見附錄B。

空白對照試驗：

取10L同批次試驗用水，按以上采樣及分析步驟進行全程序樣品的測定。

結(jié)果計算于表示：

計算結(jié)果：

C------水樣中蛔蟲卵濃度（個/10L）

N-----檢測到的所有蛔蟲卵數(shù)（個）

Q-----實際水樣體積（10L）

結(jié)果表示：

      水質(zhì)中蛔蟲卵的測定，實驗終結(jié)果取整數(shù)，以“個/10L”為單位

精密度：

6家實驗室分別對實際樣品和低濃度(20 個/10L)、中濃度(40 個/10L)、高濃度(80個/10L)自配樣品的蛔蟲卵進行測定，實驗室內(nèi)相對標準偏差范圍分別為:6.5%~18.9%，10.1%~22.0%，12.8%~23.8%， 8.9%~ 17.4%;實驗室間相對標準偏差分別為5.8%、5. 5%、4.9%、4.8%; 重復(fù)性限(個/10L)為244、3、7、11;再現(xiàn)性限(個/10L)為260、3、7、11。

質(zhì)量保證和質(zhì)量控制：

      每批次樣品至少做1個全程序空白實驗，并取10%的樣品進行平行樣測定，全程序空白實驗不得檢出蛔蟲卵，平行樣間的相對偏差不得超過30%。

廢物處理：

      實驗中虹吸液煮沸10min后可按普通廢棄物處理，含乙酸乙酯的廢棄液應(yīng)集中保管，委托有資質(zhì)的單位進行處理。

注意事項：

實驗用過的器具均需進行高溫滅活，置于水中煮沸10min后方可再次使用。

      實驗操作人員要注意自身防護，試驗時要穿戴工作服、乳膠手套、及口罩等，同時還要避免蛔蟲卵的樣品污染實驗室環(huán)境。

附錄A

硝酸鈉水中溶解度、離心機離心力及轉(zhuǎn)速計算公式

A.1  硝酸鈉在水中的溶解度

表A.1   硝酸鈉水中溶解度

A.2離心力計算公式：

附錄B

蛔蟲卵的檢定

B.1蛔蟲卵的形態(tài)特征

B.1.1受精蛔蟲卵

      蟲卵呈短橢圓形，大小為45 μm~75 μmx35 μm~ 50 μm。卵殼很厚，自外向內(nèi)分為三層:受精膜、殼質(zhì)層和蛔甙層，殼質(zhì)層較厚，另兩層極薄，在普通顯微鏡下難以分清。卵殼內(nèi)有一個大而圓未分裂的受精卵細胞，與卵殼間常見有新月形空隙。卵殼外有一層由蟲體子宮分泌形成的蛋白質(zhì)膜，其表面凹凸不平呈波浪狀。隨糞便排出的蟲卵常被膽汁染成黃色或棕褐色。

B.1.2未受精蛔蟲卵

      蟲卵呈長橢圓形或不規(guī)則形，大小為88 μm~94 μmx39 μm ~44 μm，卵殼與蛋自質(zhì)膜均較受精蛔蟲卵薄，淡黃色，無蛔甙層，卵殼內(nèi)含有許多大小不一的屈光顆粒。

B.1.3感染期蛔蟲卵

      卵內(nèi)含有一.條卷曲的幼蟲。

B.1.4蛋白質(zhì)膜脫落的蛔蟲卵

      若蛔蟲卵的蛋白質(zhì)膜脫落，卵殼則呈無色透明，應(yīng)注意與其他線蟲卵的鑒別。

B.2蛔蟲卵參考圖片

B.2.1蛔蟲卵模式圖

B.2.2發(fā)育各階段的蛔蟲卵

附錄C

蛔蟲卵配置樣品的制備

豬蛔蟲(Ascaris suum)活成蟲采集自屠宰場，用蒸餾水洗滌干凈后，放置于含4 %甲醛溶液內(nèi)，0 C~4 C保存?zhèn)溆茫砷L期保存。

      制備蛔蟲卵備用液時，選取2~3條雌性蛔蟲，用75 %乙醇消毒過的解剖刀，劃開蟲體，每條蛔蟲一- 對子宮選取靠近陰門的一段(2 mm~3 mm),解剖后，將含蛔蟲卵的內(nèi)容物及組織碎片放入50ml離心管中，加入數(shù)顆直徑1mm玻璃珠及10ml生理鹽水，混勻后于渦旋混勻器振蕩3min~5min,用260目網(wǎng)過篩，取40ml生理鹽水分數(shù)次沖洗離心管和篩網(wǎng)，此時獲得的濾液中蛔蟲卵呈單個狀態(tài)存在。濾液加入甲醛至終濃度為4%，0 C~4 C保存?zhèn)溆?，可保?/span>1個月。即制即用時可不添加甲醛。

      制備配制樣品時，搖勻蛔蟲卵備用液，用1000 μ1微量移液器，立即吸取適量的蛔蟲卵備用液于1ml定量計數(shù)框(網(wǎng)格)中，計數(shù)后用250μl微量移液器向計數(shù)框中添加或移出蛔蟲卵至所需數(shù)量。將計數(shù)框中所有的液體用吐溫80溶液沖洗入配制樣品中。再在顯微鏡下檢測計數(shù)框，確保無蛔蟲卵殘留。