擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

實(shí)驗(yàn)試劑

0.2%的Triton X-100，10%的次氯酸鈉，含20 mg/L Hygromycin的MS培養(yǎng)基，X-Gluc，75%乙醇，0.25 N NaOH，0.25 N HCl，Buffer ( 0.5 M Tris-HCl，pH 8.0，0.25%NP40)，RNase freeDNase (Promega)

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

抽真空泵，培養(yǎng)箱，PCR儀，電泳裝置，水浴鍋

實(shí)驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因擬南芥種子

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 擬南芥陽(yáng)性苗的篩選

   1) 將收獲的轉(zhuǎn)基因種子用0.2%的Triton X-100浸泡10 min;

   2) 用10%的次氯酸鈉表而消毒12 min;

   3) 滅菌水洗滌3次，每2 min一次;

   4) 用水將種子鋪在含20 mg/L Hygromycin的MS培養(yǎng)基上，4℃黑暗培養(yǎng)2天;

   5) 22℃，16 hr光照培養(yǎng)。經(jīng)Hygromycin篩選后仍然長(zhǎng)勢(shì)良好，株高高者可初步確定為陽(yáng)性苗。

2. GUS基因表達(dá)分析

將轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片取樣后，加入含有緩沖液和底物(X-Gluc終濃度為0.5 mg/ml)的離心管中，真空抽氣使材料*沒(méi)入反應(yīng)液后取出，37℃下染色過(guò)夜，經(jīng)75%乙醇脫色后觀察GUS染情況。

3. 組織PCR

   1) 1X1mm的組織，加入40 ul 0.25 N NaOH煮沸30s;

   2) 加入40 ul 0.25 N HCl和20 ul buffer ( 0.5 M Tris-HCl，pH 8.0，0.25%NP40)。

   3) 煮沸2 min，棄液體部分;

   4) 加50 ul PCR反應(yīng)混合液。

4. RT-PCR分析

取野生型及轉(zhuǎn)基因水稻各株系T2代葉片提取總RNA，經(jīng)RNase freeDNase (Promega)處理總RNA后，各取2 ug進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。分裝，-20℃保存。

根據(jù)擬南芥的actin序列設(shè)計(jì)引物

Araactin 1：5'-TGGTGTCATGGTTGGGATG-3'

Araactin2：5'-CACCACTGAGCACAATGTTAC-3'

分別以引物:

P99：5'atggcgcttgcgggactttatc3'

P224：5'cagttccagtctgaccgaaagc3’

MFS：5'-CGGGGACAGATCATCA-3'

MFA：5'-CATAATGAAATGAAACTA-3’

進(jìn)行RT-PCR，對(duì)目的基因AsPCSl和AsMT2a的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。