第四節(jié) 細胞計數(shù)及活力測定

一、原理 培養(yǎng)的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示。細胞計數(shù)的原理和方法與血細胞計數(shù)相同。

在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。

用臺盼蘭染細胞，死細胞著色，活細胞不著色，從而可以區(qū)分死細胞與活細胞。利用細胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應，也可測定細胞相對數(shù)和相對活力。 

二、儀器、用品與試劑

1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計數(shù)板、試管、吸管、酶標儀（或分光光度計）

2、試劑：0.4％臺盼蘭，0.5％四甲基偶氮唑鹽（MTT）、酸化異丙醇

3、材料：細胞懸液

三、操作步驟

（一）細胞計數(shù)

1、將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。

2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：

細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/ 4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。

（二）細胞活力

1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中。

2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計細胞活力。

死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細胞計數(shù)合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。

（三）MTT法測細胞相對數(shù)和相對活力

活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細胞內(nèi)和細胞周圍。其量與細胞數(shù)呈正比，也與細胞活力呈正比。

l、細胞懸液以1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

2、沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成懸液。

3、37℃下保溫2小時。

4、加入4—5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。

5、1000 rpm離心，取上清液酶標儀或分光光度計570nm比色，酸化異丙醇調(diào)零點。

注意：MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細胞數(shù)。

第五節(jié) 細胞的分裂指數(shù)

一、原理:體外培養(yǎng)細胞生長、分裂繁殖的能力，可用分裂指數(shù)來表示。它與生長曲線有一定的，如隨著分裂指數(shù)的不斷提高，細胞也就進入了指數(shù)生長期。分裂指數(shù)指細胞群體中分裂細胞所占的百分比，它是測定細胞周期的一個重要指標，也是不同實驗研究選擇細胞的重要依據(jù)。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器與用品：CO2培養(yǎng)箱、普通顯微鏡、細胞培養(yǎng)血、蓋玻片、吸管

2、試劑：培養(yǎng)液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液 

三、操作步驟

1、消化細胞，將細胞懸液接至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中。

2、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，使細胞長在蓋片上。

3、取出蓋片，按下列順序操作：

PBS漂洗3分鐘→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分鐘→Giemsa液染色10分鐘→自來水沖洗。

4、蓋片晾干后反扣在載玻片上，鏡檢。

5、計算:

分裂指數(shù)=分裂細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%

四、注意事項;操作時動作要輕，以免使蓋片上的細胞脫落。

第六節(jié) 細胞周期的測定

一、原理:細胞周期指細胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。

單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數(shù)法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細胞DNA復制的原料，經(jīng)過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經(jīng)歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器、用品：同常規(guī)細胞培養(yǎng)

2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

三、操作步驟

1、細胞生長至指數(shù)期時，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使zui終濃度為10μg/ml。

2、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3、48小時后常規(guī)消化細胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。

4、常規(guī)染色體制片（見第三部分：染色體技術(shù)）。

5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。

6、棄去2×SSC液，流水沖洗。

7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

8、鏡檢100個分裂相，計*、二、三、四細胞期分裂指數(shù)。

9、計算：

細胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時） 

第七節(jié) 培養(yǎng)物的污染及防止

按現(xiàn)代的觀念，凡是混入培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存產(chǎn)生有害的成分和造成細胞不純的異物都應該視為污染。根據(jù)這一概念，組織培養(yǎng)污染物應包括生物（真菌、細菌、病毒和支原體）、化學物質(zhì)（影響細胞生存、非細胞所需的化學成分）、細胞（非同種的其他細胞）。其中一微生物zui為多見。另外，隨著使用細胞種類增多，不同細胞交叉污染，尤其是Hela細胞的污染也時有發(fā)生，從而造成細胞不純。

一、污染途徑 污染物，特別是微生物常通過下列途徑進入培養(yǎng)體系，造成污染

1、空氣：空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑?？諝饬鲃有源?，如果培養(yǎng)操作場地于外界隔離不嚴格或消毒不充分，外界不潔空氣很容易進入造成污染。因此，培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風場所。無菌操作應在凈化臺內(nèi)進行，工作時要帶口罩，以免因講話、咳嗽等使外界污染進入操作面，造成污染。

2、器材：各種培養(yǎng)器皿、器械消毒不*和洗刷不干凈導致污染，另外需要對培養(yǎng)箱進行定期消毒，防止形成污染

3、操作：實驗操作無菌觀念不強，技術(shù)不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴等，都可以造成污染。培養(yǎng)兩種細胞以上時，操作不規(guī)范，交叉使用吸管或培養(yǎng)液、瓶等有可能導致細胞交叉污染。

4、血清：有些血清在生產(chǎn)時就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染。

5、組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；取材時碘酒消毒后脫碘不*，可造成碘混入組織，細胞或培養(yǎng)液中，影響細胞細胞生長。

二、污染對培養(yǎng)細胞的影響及污染的檢測

由于體外培養(yǎng)細胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中的抗生素抗污染能力有限，因而培養(yǎng)細胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。細胞污染早期或污染程度較輕時，如果能及時去除污染物，部分細胞有可能恢復、但是當污染物持續(xù)存在培養(yǎng)環(huán)境中，輕者細胞生長緩慢，分類象減少，細胞變得粗糙，輪廓增強細胞漿出現(xiàn)顆粒、污染較嚴重，細胞增值停止，分裂象消失，細胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細胞變圓、脫壁。

（一）細菌污染對培養(yǎng)細胞的影響及污染物的檢測

常見的污染細菌有大腸桿菌、假單孢菌、葡萄球菌等。細菌污染初期由于培養(yǎng)體系的抗生素作用， 其繁殖處于抑制狀態(tài)，細胞生長不受明顯影響，污染情況用倒置顯微鏡觀察不易判斷。懷疑培養(yǎng)細胞有細菌污染時，取10ml細胞懸液離心1000轉(zhuǎn)5分鐘，沉淀中加入無抗生素培養(yǎng)液2ml,將細胞放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

如果培養(yǎng)無真的細菌污染，24小時內(nèi)可以獲得陽性結(jié)果。當污染的細菌量比較大或者細菌增殖到一定基數(shù)時，大約每20分鐘一代，會使培養(yǎng)系統(tǒng)中很快產(chǎn)生大量細菌，后者不僅可以消耗培養(yǎng)系統(tǒng)中的養(yǎng)分，還能釋放大量代謝產(chǎn)物。幾個小時后，增殖的細菌就可以導致培養(yǎng)液外觀渾濁，肉眼就可以判斷。細菌污染大多數(shù)可以改變培養(yǎng)液pH，使培養(yǎng)液變渾濁、變色。用相差顯微鏡觀察，可見滿視野都是點狀的細菌顆粒，原來的清晰培養(yǎng)背景變得模糊，大量的細菌甚至可以覆蓋細胞，對細胞的生存構(gòu)成威脅。用青霉素、鏈霉素可以預防細菌污染有效。

（二）真菌污染對細胞的影響及污染物的檢測

微生物污染中以真菌zui多，真菌種類繁多，形態(tài)各異，但是污染后易于發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下可見呈絲狀、管狀、樹枝狀，縱橫交錯穿行于細胞之間。念珠菌和酵母菌卵圓形，散在細胞周邊和細胞之間生長。真菌生長迅速，能在短時間內(nèi)抑制細胞生長、產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺死細胞。抗真菌制劑對預防和排除真菌污染有效。

（三）支原體污染對細胞影響及污染物的檢測

細胞培養(yǎng)（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題,是細胞培養(yǎng)zui常見的、干擾試驗結(jié)果的一種污染。但由于不易被察覺，有些污染的細胞仍在被應用。研究表明，95％以上是以下四種：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是zui常見的污染細胞培養(yǎng)的支原體菌群，但能夠污染細胞的支原體種類是很多的，國外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。據(jù)查，目前各實驗室使用的二倍體細胞和傳代細胞中約有11%的細胞受到支原體污染。

污染來源包括工作環(huán)境污染、操作者本身污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。支原體污染后，因為它們不會使細胞死亡可以與細胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實則細胞手到多方面潛在影響，如引起細胞變形，影響DNA合成，抑制細胞生長等。

細胞培養(yǎng)中，主要從以下幾個方面來預防支原體的污染：

控制環(huán)境污染；

嚴格實驗操作；

細胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌；

在細胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。

支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理。支原體zui突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細胞壁，一般來講，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如 -內(nèi)酰胺類、萬古霉素等*不敏感；對多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體zui有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學治療劑。 

（四）細胞交叉污染對細胞的影響及污染物的檢測

細胞培養(yǎng)中，細胞間交叉污染并不罕見，多是由于在培養(yǎng)中操作時各種細胞同時進行，混雜使用器皿和液體所致，這種污染能使細胞的生長特性、形態(tài)特征等發(fā)生變化，有些變化較輕、不易察覺，有些可能由于污染的細胞具有生長優(yōu)勢zui終壓過原來細胞而導致細胞的生長抑制，zui終死亡。常用觀察細胞形態(tài)學、分析生長特性和核型、檢測細胞的標記物等方法檢測交叉污染的細胞。

三、污染的預防:防止污染，預防是關(guān)鍵，預防措施應該貫穿整個細胞培養(yǎng)的始終。

1、器皿準備中的預防：用于細胞培養(yǎng)的器皿應該嚴格消毒，做到真正潔凈；應該無菌的物品，要做到消毒嚴格、真正無菌；器皿的運輸、貯存過程中，要嚴格操作，謹防污染。

2、開始操作前的預防：應當按廠家規(guī)定，定期清洗或更換超凈臺的空氣濾網(wǎng)，請專職人員定期檢查超凈臺的空氣凈化標準；檢查培養(yǎng)皿是否有消毒標志，有條件得實驗室可以使用一次性用品；檢查新配置的培養(yǎng)液，確認無菌方可使用；操作前提前半小時啟動超凈臺的紫外燈消毒；操作應戴口罩，消毒雙手。

3、操作過程中的預防；主要包括：超凈臺內(nèi)放置的所有培養(yǎng)瓶瓶口不能與風向相逆，不允許用手觸及器皿的無菌部分，如瓶口和瓶塞內(nèi)側(cè)；在安裝吸管冒、開啟或封閉瓶口操作時要經(jīng)過酒精燈燒灼，并在火焰附件工作；吸取培養(yǎng)液、細胞懸液等液體時，應專管，防止污染擴大或造成培養(yǎng)物的交叉污染；使用培養(yǎng)液前，不易較早開啟瓶口；開瓶后的培養(yǎng)瓶應保持斜位，避免直立；不再使用的培養(yǎng)液應立即封口；培養(yǎng)的細胞在處理之前不要過早的暴露空氣中；操作時不要交談、咳嗽，以防唾沫和呼出氣流引發(fā)污染；操作完畢后應將工作臺面整理好，并消毒擦拭工作面，關(guān)閉超凈臺。

4、其他預防：及早凍存培養(yǎng)物；重要的細胞株傳代工作應有兩個人獨立進行；購入的未滅活血清應采取56度水浴滅活30分鐘使血清的補體和支原體滅活；為了避免誘導抗藥細菌，應定期更換培養(yǎng)系統(tǒng)的抗生素，或盡可能不用抗生素；對新購入的細胞株應加強觀察，防止外來的污染源；定期消毒培養(yǎng)箱。

四、污染的排除:培養(yǎng)的細胞一旦污染應及時處理，防止污染其他細胞。通常選高壓滅菌被污染的細胞，然后棄掉。如果有價值的細胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時排除污染物，挽救細胞恢復正常。常用的排除微生物污染的方法有以下幾種：

1、抗生素排除法：抗生素是細胞培養(yǎng)中殺滅細菌的主要手段。各種抗生素性質(zhì)不同，對微生物作用也不同，聯(lián)合應用比單用效果好，預防性應用比污染后應用好；如果發(fā)生微生物污染后再使用抗生素，常難以*。有的抗生素對細菌僅有抑制作用，無殺滅效應。反復使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且對細胞本身也有一定影響，因此有人主張盡量不用抗生素處理，當然，一些有價值的細胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在這種情況下，可采用5－10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24－48小時，再換入常規(guī)的培養(yǎng)液，有時可以奏效。

2、加溫除菌：根據(jù)支原體耐熱性能差的特點。有人將受支原體污染的細胞置于41度中作用5－10小時（zui長可以達18小時）殺滅支原體。但是41度對細胞本身應有較大影響，故在處理前，應*行預試驗，確定zui大限度殺傷支原體而對細胞影響較小的處理時間。

3、動物體內(nèi)接種：受微生物污染的腫瘤細胞可以接種到同種動物皮下或腹腔，借動物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅掉微生物，腫瘤細胞卻能在體內(nèi)生長，待一定時間，從體內(nèi)取出再進行培養(yǎng)繁殖。

4、與巨噬細胞共培養(yǎng)：在良好的體外培養(yǎng)條件下巨噬細胞可以存活7－10天，并可以分泌一些細胞因子支持其他細胞的科隆生長。與體內(nèi)情況相似，巨噬細胞在體外條件下仍然可以吞噬微生物并將其消化。利用96孔板將極少培養(yǎng)細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細胞、極大地降低微生物污染程度地同時，更有效地發(fā)揮巨噬細胞清除污染地效能。本方法與抗生素聯(lián)合應用效果更佳。