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CloneJET PCR克隆試劑盒
  • CloneJET PCR克隆試劑盒
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更新時(shí)間:2025-03-03 21:00:07

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ThermoScientific™CloneJET™PCRCloningKit是一個(gè)的陽(yáng)性選擇克隆系統(tǒng),可以高效克隆各種PCR產(chǎn)物和任何具有平末端或粘性末端的DNA片段

    Thermo Scientific™ CloneJET™ PCR Cloning Kit是一個(gè)的陽(yáng)性選擇克隆系統(tǒng),可以高效克隆各種PCR產(chǎn)物和任何具有平末端或粘性末端的DNA片段。該試劑盒對(duì)磷酸化或非磷酸化的DNA片段都有效。陽(yáng)性選擇載體和插入片段連接僅需5分鐘即可獲得超過(guò)99%的陽(yáng)性重組克隆。PCR產(chǎn)物無(wú)需純化。由具有校正活性的聚合酶(如:Pfu polymerase)擴(kuò)增的平末端PCR產(chǎn)物可直接連入克隆載體。由無(wú)校正活性的聚合酶(如:Taq polymerase)或聚合酶混合物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在連接前需用試劑盒提供的熱穩(wěn)定DNA平端化酶削平突出末端(5分鐘即可)。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化常用的大腸桿菌菌株。


    試劑盒提供一個(gè)新穎的即用型陽(yáng)性選擇克隆載體pJET2.1/blunt。該載體含有致死的限制酶基因(內(nèi)含多克隆位點(diǎn))。多克隆位點(diǎn)插入外源片段會(huì)引起酶基因失活。因此只有轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的細(xì)菌才能存活形成克隆菌落。而自身環(huán)化的pJET1.2/blunt載體表達(dá)致死的限制酶(無(wú)外源片段插入),轉(zhuǎn)化后殺死大腸桿菌細(xì)胞。這種陽(yáng)性篩選策略極大地加速了克隆篩選進(jìn)程,節(jié)省了藍(lán)白斑篩選的額外費(fèi)用。


    為方便酶切作圖和插入片段基因操作,pJET1.2/blunt克隆載體的多克隆位點(diǎn)兩側(cè)各包含一個(gè)BglII識(shí)別序列。此外,該載體含有T7啟動(dòng)子,可用于體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄、插入片段測(cè)序等研究。

    特點(diǎn)

    • 快速 一 PCR克隆只需5分鐘。
    • 高效 一 >99%陽(yáng)性克隆。
    • 無(wú)克隆背景 一 陽(yáng)性篩選載體。
    • 通用一適合平末端和粘性末端克隆。
    • 經(jīng)濟(jì) 一 無(wú)需昂貴的藍(lán)白篩選。


    應(yīng)用

    • 適用平末端和帶有3'-dA尾的PCR產(chǎn)物克隆。
    • 限制酶切割產(chǎn)物克隆。
    • 測(cè)序克隆的DNA。
    • 克隆插入片段體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)錄(T7啟動(dòng)子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄)。

    質(zhì)量控制
    功能測(cè)試:含有3’-dA尾的對(duì)照PCR產(chǎn)物克隆證明重組子比率>99%。載體自連實(shí)驗(yàn)表明無(wú)克隆背景。pJET1.2 primers適合特異性高效測(cè)序。
    組分
    • pJET1.2/blunt Cloning Vector (pJET1.2 DNA sequence in txt format)
    • T4 DNA Ligase
    • 2X Reaction Buffer
    • Blunting Enzyme
    • pJET1.2 Forward Sequencing Primer
    • pJET1.2 Reverse Sequencing Primer
    • Control PCR Product (sequence of control PCR product in txt format)
    • Water, nuclease-free
    • 詳細(xì)的操作手冊(cè)
    備注
    電轉(zhuǎn)化前,需用氯仿抽提使連接產(chǎn)物中的T4 DNA連接酶失活。

    表1.CloneJET™ 克隆步驟。
    圖1.pJET1.2/blunt 載體圖譜。
    pJET1.2/blunt 載體圖譜 (pdf, 188??B). pJET1.2 DNA 序列 (*.txt file).
    圖2.平末端PCR產(chǎn)物克?。憾喾N平末端PCR產(chǎn)物克隆系統(tǒng)(陽(yáng)性選擇)的效率比較。
    Pfu DNA Polymerase擴(kuò)增976 bp的PCR產(chǎn)物(平末端)直接連入不同的陽(yáng)性篩選克隆載體(所有操作均嚴(yán)格按照生產(chǎn)商的操作說(shuō)明)。連接產(chǎn)物(2 μl)轉(zhuǎn)化E.coli DH10B感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率為1x107重組子/μg 超螺旋DNA。
    圖3.含有3’-dA尾的PCR產(chǎn)物克?。翰煌琍CR克隆策略的效率比較。
    Taq DNA Polymerase擴(kuò)增976 bp的PCR產(chǎn)物(含3'-dA尾)連入pJET1.2/blunt載體和其它TA克隆載體(所有操作均嚴(yán)格按照生產(chǎn)商的操作說(shuō)明)。連接產(chǎn)物(2 μl)轉(zhuǎn)化E.coli DH10B感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率為1x107重組子/μg超螺旋DNA。

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    貨號(hào) 產(chǎn)品名稱 規(guī)格
    K1231 CloneJET PCR Cloning Kit 20 rxns
    K1232 CloneJET PCR Cloning Kit 40 rxns

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