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ESCO PCR儀反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 標準的PCR反應(yīng)體系： 10×擴增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至 100ul PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。
理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC較好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
⑤引物3’端的堿基，特別是較末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列較好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。
dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。
HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。
多次凍融會使dNTP降解。
在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。
濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。
dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。
每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
ESCOPCR儀熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。
現(xiàn)將其原理簡述如下：
熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。
探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
ESCOPCR儀公司各部門實行崗位責(zé)任制、獎罰責(zé)任制、績效考核制，每位員工統(tǒng)一服裝，統(tǒng)一工作牌。真正做到公司及合作廠家的形象化、制度化、網(wǎng)絡(luò)化、信息化；真正讓每位用戶享受到真誠、優(yōu)質(zhì)、高效、便捷的貼心服務(wù)。