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[供應]RochePCR儀售后統(tǒng)一維修電話_華南地區(qū)
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  • RochePCR儀售后統(tǒng)一維修電話_華南地區(qū)
貨物所在地:
廣東
更新時間:
2023-06-26 18:37:19
有效期:
2022年3月24日 -- 2024年6月26日
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產(chǎn)品簡介

詳細介紹

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RochePCR儀 - 技術(shù)原理;
DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶與啟動子的參與下,根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在聚合酶鏈式反應實驗中發(fā)現(xiàn),DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,并設(shè)計引物做啟動子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術(shù)的應用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環(huán)加酶,使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術(shù)得以大量應用,并逐步應用于臨床。

1)內(nèi)參照法:在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物,內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標與靶模板的長度不同,二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高 效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。

2)競爭法:選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高 效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

2.內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的作用

由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測,即PCR到達平臺期后進行檢測,而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時,檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗,所得結(jié)果有很大差異,因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標后,可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此,傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

建立樣品準備區(qū)

這個區(qū)域?qū)iT用作樣品的準備,在制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采取預防措施:⑴PCR產(chǎn)物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。⑵組織培養(yǎng)物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理,以根據(jù)應用的需要提取DNA或RNA。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作,以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生,而且管子不能用力崩開,這樣會產(chǎn)生氣溶膠。⑺任何時候都應該穿實驗服和帶手套,手套要經(jīng)常更換,尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間,經(jīng)常清洗。

2、樣品準備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作,這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題,反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準備區(qū)進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。

3、建立前PCR區(qū)。

該去專門用于準備各種反應,這個區(qū)域必須保持干凈,而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準備,特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。

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