豬流感病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒用途 A 型流感病毒反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測試劑盒，用于檢測豬、禽等動物組織、分泌物和排泄物中 A 型流感病毒，適用于豬、禽等動物流感病毒的檢測、診斷和流行病學調(diào)查。
原理 針對 A 型流感病毒 NP 基因，設計特異性引物，進行反轉錄聚合酶鏈反應，以檢測各種動物樣品中的 A 型流感病毒。利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取 RNA，在反轉錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引物為起點合成與 RNA 模板互補的 cDNA 鏈。在 TaqDNA 聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異 DNA 段的拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過 35 次循環(huán)，最終使擴增 DNA 段放大數(shù)百萬倍。將擴增 DNA 段進行電泳，經(jīng)染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到 DNA 段的擴增帶。
試劑盒組成

保存期 本產(chǎn)品有效期為 6 個月。
需自備的物品
1．儀器：分析天平、離心機、PCR 擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、微波爐、
組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20 mL 一次性注射器、生理鹽水、瓊脂糖、500 mL 量筒、500 mL 錐
形瓶、經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理的滅菌 1.5mL 離心管和吸頭（10 µL、200 µL、1000 µL）、滅菌雙
蒸水。
豬流感病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒注意事項
1．所有接觸病料的物品均應合理處置，以免污染實驗室。
2．PCR 整個試驗分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴增區(qū)→
電泳區(qū)。嚴禁器材和試劑倒流。
3．所有試劑應在規(guī)定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應*融化，8000 rpm 離心 15 s，使液體
全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立即放回-20 ℃。
4．在 RNA 提取過程中，避免 RNA 酶污染，盡量縮短操作時間。
5． 染色液低毒，操作時應戴上手套，避光保存，較長時間不使用請存放于 4℃，以免揮發(fā)變干。染色液
和上樣緩沖液使用前也請離心使液體沉于管底。
6．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
7．嚴格遵守操作說明可以獲得最的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
8．反復凍融試劑將減低檢測靈敏度，建議在 3 次內(nèi)用完，請嚴格按試劑盒說明書操作。
樣品制備
1 樣品采集：病死或撲殺豬、禽等，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活豬、禽等，用棉拭子
取呼吸道分泌物或排泄物，置于 50%甘油生理鹽水中。2～8 ℃保存，送實驗室檢測。（要求送檢病料新鮮，
嚴禁反復凍融。）
2 樣品處理：每份樣品分別處理。
2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約 1g，用手術剪剪碎混勻后取 0.05 g 于研磨
器中研磨，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm 離心 2 min，
取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.2 全血樣品處理：待血凝后取血清 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.3 陽性對照處理：取陽性對照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.4 陰性對照處理：取陰性對照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
操作步驟
1 病毒 RNA 的提取
1.1 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入裂解液 600 µL，充分顛倒混勻，室溫靜置 3～5 min。
1.2 將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時堵塞吸
附柱），13000 rpm 離心 30 s。
1.3 棄去收集管中液體，加入 600 µL 洗液，13000 rpm 離心 30 s。
1.4 重復步驟 1.3。
1.5 棄去收集管中液體，13000 rpm 空柱離心 2 min，以除去殘留的洗滌液。
1.6 將吸附柱移入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入洗脫液 50 µL，室溫靜置 1 min，13000 rpm 離心 30
s，離心管中液體即為模板 RNA。
2 RT-PCR 擴增
每份總體積 20 µL，含 16.8 µL RT-PCR 反應液（用前混勻），1.2 µL 酶混合液，2 µL 模板 RNA。
例如：n 份樣品，配制 n+1 份，16.8×（n+1）RT-PCR 反應液，再加入 1.2×（n+1）酶混合液，混勻
后取 18 µL 分裝成 n 份，分別加入 2 µL 模板 RNA，加入礦物油 20 µL 覆蓋（有熱蓋的 PCR 擴增儀不用加
礦物油），作好標記。
在 PCR 擴增儀上進行以下程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min；循環(huán) 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，
共 35 次；再 72 ℃延伸 10 min。
3 電泳
稱 3 g 瓊脂糖放于 500 mL 錐形瓶中，加入 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液 200 mL（取 4 mL 50 倍 TAE
電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至 200 mL），于微波爐中熔解，再加入 10 µL 染色液混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳
子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將 PCR 擴增產(chǎn)物 10 µL 混合 2 µL 上樣緩沖液，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，
以 110～120V 電壓于 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結果。
結果判定 陽性對照出現(xiàn) 330 bp 擴增帶、陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時，實驗結果成立。被檢
樣品出現(xiàn) 330 bp 擴增帶為 A 型流感病毒陽性，否則為陰性。
亞型鑒定 陽性樣品分別采用 H1、H3、H5 及 H9 等亞型 RT-PCR 試劑進行進一步的檢測，必要時進
行基因序列測定，以確定流感病毒的亞型。