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產(chǎn)品描述

活性氧(ROS)檢測試劑盒包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，參與細(xì)胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。李記生物的活性氧檢測試劑盒（Meilun Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一種基于熒光染料DCFH-DA (2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate) 的熒光強(qiáng)度變化，定量檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的常用方法。

DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被標(biāo)記到細(xì)胞內(nèi)。在活性氧存在的條件下，DCFH被氧化生成熒光物質(zhì)DCF，綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比，檢測DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。在激發(fā)波長502 nm，發(fā)射波長530 nm附近，使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等檢測DCF熒光，從而測定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。

本試劑盒背景低、靈敏度高、線性范圍寬、使用方便，可用于各種真核培養(yǎng)細(xì)胞的檢測，且提供了活性氧陽性對照試劑Rosup，便于活性氧的檢測。以96孔板每孔加樣量為標(biāo)準(zhǔn)，本試劑盒可測定約100次。

訂購信息

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存

藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃避光保存，有效期12個(gè)月。

使用方法

一、裝載探針

刺激時(shí)間較短（通常為2 h以內(nèi)）的細(xì)胞：先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。

刺激時(shí)間較長（通常為6 h以上）的細(xì)胞：先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。

1.     原位裝載探針（僅適用于貼壁細(xì)胞）

(1)   細(xì)胞準(zhǔn)備：檢測前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，確保檢測時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到50~70%?！咀ⅰ浚罕仨毐ＷC細(xì)胞狀態(tài)健康，且檢測時(shí)不會(huì)過度生長。

(2)   探針準(zhǔn)備：探針裝載前按照1:1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

(3)   探針裝載：吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA 工作液。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，【例】：6 孔板通常不少于1000 μL；96 孔板通常不少于100 μL。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20~30 min。

(4)   細(xì)胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

(5)   藥物誘導(dǎo)：加入適量經(jīng)合適的緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)藥物本身特性，以及細(xì)胞類型來決定。

(5)（可選）陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等1:1000 稀釋陽性對照（Rosup, 50mg/ml）到常用工作濃度100 μg/ml，加入細(xì)胞，一般37℃避光孵育20~30 min 可顯著看到活性氧水平提高，但依細(xì)胞類型會(huì)有比較明顯差異。（如，HeLa 細(xì)胞孵育30 min；MRC5人胚胎成纖維細(xì)胞1.5 h）

2.     收集細(xì)胞后裝載探針（適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞）

(1)   細(xì)胞準(zhǔn)備：按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞，必須保證檢測用細(xì)胞狀態(tài)健康。按照適當(dāng)方法，清洗并收集足量的細(xì)胞。

(2)   探針準(zhǔn)備：探針裝載前，按照1:1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

(3)   探針裝載：細(xì)胞收集后懸浮于加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA 工作液，使其細(xì)胞密度為1.0×106~2.0×107/mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20~30 min，每隔3-5 min 顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸?！咀ⅰ浚杭?xì)胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進(jìn)行調(diào)整。【例】：對于流式分析，單管檢測內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不少于104，也不可多于106。

(4)   細(xì)胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

(5)   藥物誘導(dǎo)：將細(xì)胞懸浮于適量經(jīng)合適的緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物中，或把細(xì)胞等分成若干份后進(jìn)行藥物刺激，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導(dǎo)時(shí)間按藥物本身特性，以及細(xì)胞類型來決定。

(5)（可選）陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等1:1000 稀釋陽性對照（Rosup, 50mg/ml）到常用工作濃度100 μg/ml，加入細(xì)胞，一般37℃避光孵育20~30 min 可顯著看到活性氧水平提高，但依細(xì)胞類型會(huì)有比較明顯差異。（如，HeLa 細(xì)胞孵育30 min；MRC5人胚胎成纖維細(xì)胞1.5 h）

二、檢測

原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測。

收集細(xì)胞后裝載探針：用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

三、參數(shù)設(shè)置

使用488 nm 激發(fā)波長，525 nm 發(fā)射波長，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF 的熒光光譜和FITC 非常相似，可以用FITC 的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。DCF 的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。

四、其他事項(xiàng)說明

1.     陽性對照Rosup通常按照1:1000的比例使用。通常刺激后20~30 min可以觀察到顯著的活性氧水平升高。對于不同的細(xì)胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30 min內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可延長誘導(dǎo)時(shí)間或適當(dāng)提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可縮短誘導(dǎo)時(shí)間或適當(dāng)降低活性氧陽性對照的濃度。

2.     對于某些細(xì)胞，若沒有刺激的陰性對照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照1:2000～1:5000稀釋DCFH-DA，使裝載探針時(shí)DCFH-DA 的濃度為2～5 μM。探針裝載的時(shí)間也可以根據(jù)情況在15～60 min內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。

3.     活性氧陽性對照（Rosup）僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個(gè)樣品中都需加入活性氧陽性對照。

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2. 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會(huì)導(dǎo)致背景較高。

3. 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認(rèn)探針的裝載情況是否良好。DCF 的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜請參考上頁圖譜。

4. 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時(shí)間（刺激時(shí)間除外），以減少各種可能的誤差。

本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。