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詳細介紹
可用于活細胞的不可逆GST抑制劑
CNBSF ＜Irreversible GST Inhibitor＞
CNBSF（2-chloro-5-nitrobenzensulfonyl fluoride）是針對谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（GST）的不可逆性抑制劑。與目前已知的作為GST抑制劑廣泛使用的利尿酸相比，抑制活性明顯更高，且因其不可逆性，可長期保持GST失活。
※ 本產(chǎn)品基于名古屋大學(xué) 理科研究科 阿部洋教授的研究成果商品化而成。
※ 本產(chǎn)品僅供研究，研究以外不可使用。
添加CNBSF至HeLa細胞中不可逆地抑制細胞內(nèi)的GST后，使用用于活細胞的GST活性檢測探針DNs-Rh（#FDV-0030）觀察殘留的GST活性。可發(fā)現(xiàn)， CNBSF的添加顯著地抑制了細胞內(nèi)GST的酶活性。
◆GST以及抑制劑的含義
谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）家族是廣泛存在于細菌和動植物的酶家族，具有在細胞內(nèi)將疏水性外源性物質(zhì)（xenobiotics）結(jié)合到谷胱甘肽（GSH）中并轉(zhuǎn)換為GSH共軛物（GSH-conjugate）的活性。MRP（multidrug resistance-associated protein）轉(zhuǎn)運蛋白積極地將GSH共軛物釋放到細胞外，有著去除雜質(zhì)的功能。因此，GST作為解毒因子，將可能成為細胞毒素的外來化合物排出細胞而起作用。
另一方面，由于大多數(shù)抗癌藥等藥物也會通過GST轉(zhuǎn)換為GSH共軛物排出細胞外，因此GST作為耐藥因子，也呈現(xiàn)出了降低藥效的負面影響。尤其是隨著癌癥的惡化，特定GST亞型（GSTP1）的表達水平增強，由此可推斷出癌細胞獲得了強耐藥性。雖然可以期待通過抑制GST活性提高抗癌藥在細胞內(nèi)的滯留性，然而迄今使用的GST抑制物質(zhì)并不完善。傳統(tǒng)的GST抑制物質(zhì)主要使用與GSH競爭抑制的競爭性抑制物質(zhì)。然而，盡管這些競爭性抑制物質(zhì)在體外實驗中展現(xiàn)出色的抑制活性，但從細胞內(nèi)的情況來看，GSH濃度約為數(shù)毫摩爾便算是*濃度，在細胞內(nèi)引發(fā)競爭、獲得充分的抑制效果是十分困難的。
◆新型GST抑制策略 BSF抑制劑
名古屋大學(xué)的阿部洋教授等人使用benzensulfonyl fluoride（BSF）基作為新的GST抑制策略，致力于制造在細胞內(nèi)的不可逆性抑制物質(zhì)，并在后成功開發(fā)出在活細胞內(nèi)呈現(xiàn)出色抑制活性的CNBSF 1）。CNBSF擁有細胞膜穿透性，進入細胞后與GST的雜質(zhì)識別部位H-site結(jié)合。GSH與GST的G-site結(jié)合，CNBSF在GST的蛋白內(nèi)部附著到GSH上轉(zhuǎn)換為GSH共軛物（GS-5NBSF），而GS-5NBS立刻與GST的Tyr108（GSTP1-1時）發(fā)生不可逆反應(yīng)。這個反應(yīng)使GS-BSF無法從GST上脫離，并且由于堵塞了H-site、G-site，使GST失活。與傳統(tǒng)競爭性抑制物質(zhì)相比，這個方法能夠使GST不可逆性地失活，達到長期抑制的效果。
◆詳細原理
■ 抑制反應(yīng)機構(gòu)模型（以GSTP1-1為例）
1. CNBSF和GSH分別與GST的H-site、G-site結(jié)合，GST的酶活性依賴GSH的硫醇根陰離子與CNBSF反應(yīng)。
1. CNBSF的氯離子CI-作為離去基團而脫離。
2. 在GST酶內(nèi)生成GS-5NBSF。
3. 在GS-5NBSF的benzensulfonyl fluoride基中GSTP1-1與Tyr108發(fā)生羥基反應(yīng)。
4. 伴隨著氟離子F−的脫離，GST與GS-5NBSF通過共價鍵交聯(lián)。
◆特點
● 擁有膜穿透性，可用于活細胞
● 在細胞內(nèi)通過GST附著于GSH，作為GST抑制物質(zhì)發(fā)揮功能
● 因為是不可逆性抑制物質(zhì)，可長期抑制。另外，不同于傳統(tǒng)的可逆性化合物，在清洗后仍然保持抑制作用
● 與已知GST抑制物質(zhì)ethacrynic acid（EA）相比，在活細胞實驗中呈現(xiàn)高抑制活性
● 可與廣泛的GST家族反應(yīng)
● 經(jīng)質(zhì)譜確認本產(chǎn)品與內(nèi)源性GST（GSTP1-1）共價結(jié)合
◆原著文獻
1. Shishido, Y., et al., ChemBioChem. (in press),
1. "A covalent inhibitor for Glutathione S-Transferase Pi (GSTP1-1) in human cells."
◆應(yīng)用實例
■ 不可逆性GST抑制活性
使用GSTP1-1重組體在體外實驗評價抑制活性。GSTP1-1在含有0.1 mM抑制物質(zhì)的情況下于37°C反應(yīng)2小時，在有和無超濾清洗后，使用1 μM的GST活性檢測探針DNs-Rh（#FDV-0030）評價GST活性。從清洗后GST活性恢復(fù)可知，ethacrynic acid（EA）是可逆性抑制物質(zhì)，從CNBSF清洗后仍保持抑制活性來看，CNBSF對GST的抑制是不可逆的。
■ 活細胞中GST的抑制活性
用胰蛋白酶脫離NCI-H522細胞使其懸浮，然后添加1 mM的抑制物質(zhì)在37°C下孵育15分鐘。用PBS清洗細胞后，添加2.5 μM DNs-Rh（#FDV-0030），在37°C下反應(yīng)1小時。然后再次使用PBS清洗細胞，去除未反應(yīng)的試劑后，用流式細胞儀（Ex 490/Em 520 nm）定量。添加了CNBSF的細胞中，GST活性幾乎*消失，而且效果更甚于EA。
■ 質(zhì)譜鑒定GS-5NBSF結(jié)合位點
將化學(xué)合成的GS-5NBSF與純化GSTP1-1反應(yīng)制備不可逆的加合物。質(zhì)譜處理后，通過肽片段的MS / MS分析鑒定結(jié)合位點。結(jié)果顯示，GS-5NBSF在Tyr108處結(jié)合。
◆產(chǎn)品列表
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| FDV-0031 | CNBSF<不可逆GST抑制劑> | 10 mg |
◆相關(guān)產(chǎn)品
可用于活細胞的GST活性檢測成像探針DNs-Rh
DNs-Rh是擁有膜通透性并響應(yīng)GST酶活性而發(fā)出熒光的探針。與廣泛的GST家族成員交叉，輕松觀察細胞的總GST活性。
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| FDV-0030 | DNs-Rh<Cell-based GST Activity Assay Reagent> | 0.1 μmol |
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