GV3101 (pJIC SA_Rep) Chemically Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格 （CAT#: AC1004）

GV3101 (pJIC SA_Rep)：                                           100μl/支
pGs2（control vector，10ng/μl )                                    10μl
保存條件(保質(zhì)期)：                                         -80℃（12個月） 

基因型

C58 (rif^R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gent^R) Nopaline(pJIC SA_Rep -tet^R)

GV3101 (pJIC SA_Rep) Chemically Competent Cell產(chǎn)品說明

GV3101(pJIC SA_Rep)菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質(zhì)粒含有篩選標簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性；在GV3101菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒：pJIC SA_Rep即為GV3101(pJIC SA_Rep)菌株，可幫助pgR106，pgR107，pGreen，pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制，同時賦予該菌株四環(huán)素（tet）抗性。適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作。本公司生產(chǎn)的GV3101(pJIC SA_Rep)化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pGs2(卡那霉素抗性)質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>10³ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中。

2. 每100 μl感受態(tài)加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（轉(zhuǎn)化效率較高，一次使用前做預(yù)實驗確定所加質(zhì)粒的量），用手打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

3. 加入700 μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素（不含四環(huán)素抗性）的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天。

（當平板只含有50 μg/ml kan 時，28℃培養(yǎng)48 h即可；平板中同時加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時，需28℃培養(yǎng)60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h）。

注意事項

1. 加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量，本公司生產(chǎn)的GV3101(pJIC SA_Rep)化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞具有四環(huán)素抗性，但在轉(zhuǎn)入目標質(zhì)粒涂板篩選陽性克隆時，只需加入目標質(zhì)?？剐缘目股?，不加四環(huán)素。

3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但鏈霉素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低 (可以忽略)。