LBA4404 Electroporation-Competent Cell

產品規(guī)格

LBA4404 Elec：                                                           50μl/支
pCAMBIA2301（control vector，10ng/μl )                    10μl
保存條件(保質期)：                                         -80℃（12個月）

基因型

Ach5 (rif^R) Ti pAL4404 (strep^R) Octopine

LBA4404 Electroporation-Competent Cell產品說明

LBA4404菌株為Ach5型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的章魚堿型Ti質粒pAL4404，此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pAL4404質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。 pAL4404型Ti質粒含有篩選標簽：strep，賦予LBA4404菌株鏈霉素抗性，適用于菸草、番茄、煙草等植物的轉基因操作。開發(fā)的LBA4404電轉感受態(tài)特別適用于大質粒的轉化：經(jīng)pCAMBIA2301質粒 (size:11633 bp)檢測轉化效率>10⁵ cfu/μg DNA；經(jīng)pCAMBIA2301-ZH質粒 (size:40 kd)檢測轉化效率可達10³ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的農桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質粒DNA（體積不大于6ul，感受態(tài)轉化效率較高，一次使用前做預實驗確定所加質粒的量），用手打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態(tài)-質?；旌衔锟焖僖频诫姄舯?，蓋上杯蓋，空管保留待用。

3. 啟動電轉儀，設置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700 μl無抗生素的LB并轉移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

（當平板只含有50 μg/ml kan 時，28℃培養(yǎng)48 h即可；平板中同時加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時，需28℃培養(yǎng)60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h）。

備注

1、農桿菌相關抗生素配方：

2、常用農桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

3、LB及YEB配方：

注意事項

1. 加入質粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數(shù)量級。

2. 混入質粒時應輕柔操作。轉化高濃度的質粒可相應減少終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量。

4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml，過高的利福平濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態(tài)計算轉化效率時所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2。

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質粒篩選抗生素可防止Ti質粒丟失，但Ti質粒篩選抗生素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養(yǎng)農桿菌時不考慮這些抗生素，Ti質粒丟失的概率極低(可以忽略)。