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質(zhì)粒DNA提取實驗

閱讀:1682      發(fā)布時間:2018-12-15
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今日喆圖小編教大家如何提取質(zhì)粒DNA的實驗,相關(guān)設(shè)備:恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、真空干燥箱

實驗方法原理

堿裂解法是基于DNA的變性與復(fù)性差異而達到分離目的的。堿性使質(zhì)粒DNA變性,再將pH值調(diào)至中性使其復(fù)性,復(fù)性的為質(zhì)粒DNA,而染色體DNA不會復(fù)性,纏結(jié)成網(wǎng)狀物質(zhì),通過離心除去。

實驗材料

大腸桿菌

試劑、試劑盒 Tris-HclEDTA葡萄糖NaOHKAacNaAc異丙醇溶菌酶酚:Cl仿無水乙醇LB培養(yǎng)基 
儀器、耗材 超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、恒溫水浴鍋、臺式離心機取液器、低溫冰箱冷凍、真空干燥機、電泳儀水平電泳槽、紫外觀測儀 
實驗步驟 一、材料與試劑準(zhǔn)備

1. 材料:大腸桿菌。

2. 儀器:超凈工作臺,恒溫培養(yǎng)箱,搖床,恒溫水浴鍋,臺式離心機,取液器一套,低溫冰箱,冷凍真空干燥機,電泳儀,水平電泳槽,紫外觀測儀。

3. 試劑:(1)Solution I :25 mM Tris-Hcl(pH7.4),10 mM EDTA(pH8.0),50 mM葡萄糖,高壓滅菌,4℃保存。(2)Solution II :0.2 M NaOH, 1%SDS 現(xiàn)配現(xiàn)用。(3)Solution III :5 N KAc pH4.8,高壓滅菌,4℃保存。(4)3 M NaAc pH5.2,高壓滅菌,

4℃保存。(5)異丙醇,溶菌酶(8 mg/ml),酚/Cl仿,無水乙醇,70%乙醇,LB培養(yǎng)基,電泳試劑。

二、操作步驟

1. 細菌繁殖:LB培養(yǎng)基,2 ml/20 ml,37℃,200 rpm,搖一搖,過夜。

2. 離心10 min,5 000 rpm, 4℃;棄上淸液。

3. 沉淀(菌體細胞)預(yù)冷的TES緩沖液洗滌,離心10 min,5 000 rpm, 4℃,加入預(yù)冷的1 ml Solution I,冰浴10 min。

4. 重新懸浮,加入150 ul溶菌酶母液,室溫放置5 min。

5. 加入1.2 ml Solution II, 冰浴5 min。

6. 加入0.9 ml預(yù)冷乙酸鉀,混勻,離心10 min,12 000 rpm,4℃。

7. 加入1.5 ml異丙醇,-20℃冰箱內(nèi)放置15 min。

8. 離心10 min,12 000 rpm,4℃。

9. 取沉淀,懸于400 ul TE緩沖液中。

10. 加入40 ul,3 M NaAc。

11. 酚/Cl仿,抽提,乙醇沉淀。

12. 離心10 min,12 000 rpm,4℃。

13. 取沉淀,冷凍干燥,再懸浮于50 ul TE緩沖液中。

14. 電泳檢測提取DNA的質(zhì)量。

恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、真空干燥箱等實驗設(shè)備,詳情可咨詢上海喆圖編。

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