哮喘模型

小鼠明礬OVA致哮喘模型
  哮喘是一種由多種炎癥細胞及炎癥介質參與的氣道慢性炎癥性疾病，氣道炎癥、平滑肌功能紊亂和氣道重塑是哮喘的主要病理改變，發(fā)病率呈逐年增加趨勢。
  現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有多種細胞因子參與哮喘發(fā)病的調控，其中關于Th1/Th2類細胞因子失衡學說為目前的研究熱點。IFN-γ、IL-4分別是Th2、Th2細胞的特征性細胞因子，在哮喘的發(fā)病機制中，IFN-γ和IL-4的不平衡是引起IgE產生異常和哮喘發(fā)病的重要因素，調節(jié)Th1細胞因子活性或抑制Th2細胞因子已成為哮喘防治探討的新熱點。的研究發(fā)現(xiàn)在抗原刺激后氣道上皮可以使前炎性細胞因子 IL-25 表達增加，促使 IL-4 及 IL-13等 Th2 細胞因子過量表達。

1.實驗動物
  SPF級Balb/C小鼠，雄性，周齡為4w~6w，體重為20g~22g。

2.實驗分組
  實驗分六組：正常對照組、模型組、陽性藥組、受試藥組三個劑量組，每組15只動物。

3.主要試劑
  卵蛋白（OVA）
  明礬

4.實驗周期
  6W

5.建模方法
  5.1 明礬致敏佐劑：10%明礬溶液（溶于雙蒸水）2ml與500ug/ml OVA（溶于PBS）2ml等量混合后，用NAOH調PH值為6.5，室溫孵育60min，750r/min，離心5min，去掉上清液，重溶于2ml PBS。致敏時每只小鼠腹腔注射200ul，其中含2mg明礬和100ug OVA。
  5.2 致敏：小鼠分別于第0、14天時腹腔注射明礬致敏佐劑0.2ml，對照組注射相同劑量的PBS溶液，正常飲食飼養(yǎng)。
  5.3 激發(fā)：霧化吸入，第21天時小鼠放入有機玻璃箱，5% OVA霧化吸入。每天30min，共7d，zui后一次致敏后24h內檢測。以小鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌痙攣等陽性反應作為造模成功的標準。對照組采用PBS霧化吸入，其他操作均相同。
  5.4 末次激發(fā)24h麻醉小鼠，摘眼球取血，室溫靜置2h后于4℃3000r離心10分鐘提取血清，放入-80冰箱凍存。取左肺組織于4%多聚甲醛溶液中固定用于病理染色；右肺組織液氮冷凍，-80℃保存用于分生標本。

6.模型評估
  6.1 一般觀察 組大鼠在激發(fā)開始后出現(xiàn)打噴嚏、點頭呼吸、呼吸急促、哮鳴音、腹肌收縮、煩躁等典型哮喘發(fā)作癥狀，并且后期觀察中發(fā)現(xiàn)飲食減少、毛色無光澤、行動遲緩及體重逐漸下降。
  6.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集zui后1次激發(fā)24 h后(第28天)將各組小鼠頸椎脫臼處死,無菌條件下分離氣管,結扎左主支氣管后,剪開右主支氣管插入氣管導管并固定,無菌生理鹽水灌洗3次, 1mL/次,收集的BALF于4℃1200 r.min-1離心5 min,棄去上清液, PBS重懸細胞沉淀并涂片,進行細胞分類。
  6.3 肺組織病理學
  取左肺組織用4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋， 4μm切片，HE染色。正常組支氣管無明顯炎癥細胞浸潤，結構正常。哮喘組可見彌漫性細小支氣管和血管周圍炎性細胞浸潤，其中嗜酸細胞顯著增多。氣道上皮有不同程度脫落，支氣管豁膜上皮杯狀細胞增生，管腔內可見豁液栓及炎性滲出，支氣管平滑肌顯著增厚，血管周圍水腫。
  6.4 細胞因子的檢測
  模型組血清中IL-25、IL-4的含量顯著高于對照組。采用ELISA試劑盒檢測血清中IL-25、IL-4的含量。

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