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植物細胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子紅色熒光測定試劑盒
閱讀：1503 發(fā)布時間：2015-9-14保存方式
保存染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；固著液（Reagent B）和離析液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月
用戶自備
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于細胞脫離
*細胞培養(yǎng)液：用于細胞操作所需的培養(yǎng)基
15毫升錐形離心管：用于細胞操作的容器
1.5毫升離心管：用于染色液配制的容器
載玻片：用于組織染色操作
解剖針：用于植物組織解剖
血細胞計數(shù)儀：用于細胞計數(shù)
（微型）臺式離心機：用于樣品處理
培養(yǎng)箱：用于染色孵育
比色皿或酶標板：用于熒光定量分析的容器
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光分析
細胞流式儀：用于用于細胞染色分析
熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光定量分析
實驗步驟
方法一：活體組織染色
- 加上xx微升清理液（Reagent A）在載玻片上
- 切取新鮮植物根尖，放進載玻片上的清理液（Reagent A）中
- 用解剖針小心壓碎根尖
- 小心移去清理液（Reagent A）
- 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）在根尖上
- 再加上xx微升染色液（Reagent D）
- 放進37℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
- 取出載玻片，移去染色液
- 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
- 小心移去清理液（Reagent A）
- 蓋上蓋玻片，用拇指小心且垂直加壓
- 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長590nm――紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高
方法二：組織固定染色
- 加上xx微升清理液（Reagent A）在載玻片上
- 切取新鮮植物根尖，放進載玻片上的清理液（Reagent A）中
- 用解剖針小心壓碎根尖
- 小心移去清理液（Reagent A）
- 小心加上xx毫升固著液（Reagent B）
- 室溫下，孵育3小時，避免干化
- 小心移去固著液（Reagent B）
- 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
- 小心移去清理液（Reagent A）
- 小心加上xx毫升離析液（Reagent C）
- 室溫下孵育5分鐘
- 小心移去離析液（Reagent C）
- 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
- 小心移去清理液（Reagent A）
- 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）在根尖上
- 再加上xx微升染色液（Reagent D）
- 放進37℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
- 取出載玻片，移去染色液
- 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
- 小心移去清理液（Reagent A）
- 蓋上蓋玻片，用拇指小心且垂直加壓
- 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長590nm――紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高
方法三、培養(yǎng)植物細胞脫離染色
- 準備1瓶25cm2細胞培養(yǎng)瓶的待測細胞
- 小心抽去細胞培養(yǎng)液
- 加入xx毫升 清理液（Reagent A）到細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面
- 小心抽去清理液（Reagent A）
- 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面
- 置入37℃培養(yǎng)箱1分種
- 振動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
- 加入4毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液
- 移入15毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細胞直接從這一步驟開始）
- 移取10微升在血細胞計數(shù)儀上進行細胞計數(shù)
- 移出1 X 106細胞到新的15毫升錐形離心管
- 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入xx毫升清理液（Reagent A）
- 再加入xx微升染色液（Reagent D），混勻
- 放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
- 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入預(yù)冷的xx微升清理液（Reagent A），輕柔混勻細胞顆粒群
- 放進冰槽里
- 選擇下列方式之一進行操作：
- 即刻進行細胞流式儀分析：藻紅蛋白（phycoerythrin；PE）波段，觀察50000個細胞以上――
波峰右移，表明超氧陰離子含量高
- 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：
1）移取10微升上述細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片
2）激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長590nm――
紅色熒光增強，表明超氧陰離子含量高
- 或使用熒光分光光度儀或熒光酶標儀檢測（定量檢測）：
1）移取400微升上述細胞懸液到1毫升比色皿
2）加入xx微升清理液（Reagent A）
3）上下傾倒混勻數(shù)次
4）放進熒光分光光度儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長590nm――
RFU增高，表明超氧陰離子含量高