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人胚胎干細(xì)胞使用說明書
閱讀：1919 發(fā)布時間：2022-2-15人胚胎干細(xì)胞（hESC）說明書
貨號：4018106
規(guī)格：1×106
儲存條件：液氮儲存產(chǎn)品簡介：
（hESC）在無飼養(yǎng)層、化學(xué)成分明確、并且無動物源成分的人多潛能干細(xì)胞培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，適合臨床級細(xì)胞研究和應(yīng)用。hESC在人多潛能干細(xì)胞培養(yǎng)體系中可以長期穩(wěn)定快速增殖，具有典型的hESC克隆形態(tài)，表達(dá)多潛能標(biāo)志物基因，長期維持正常核型，并在體內(nèi)外具有三胚層分化潛能。
產(chǎn)品內(nèi)容：
組分代碼 名稱 規(guī)格 數(shù)量 儲存條件
4018106 人胚胎干細(xì)胞（hESC） 1×106 2 支 液氮
1002008 人多潛能干細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)基 10 mL 2 瓶 -20℃
試劑準(zhǔn)備：
?人多潛能干細(xì)胞*培養(yǎng)基：室溫解凍人多潛能干細(xì)胞添加劑，吹打混勻，隨后將添加劑加入人多潛能干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基形成*培養(yǎng)基（每0.7mL添加劑與50mL基礎(chǔ)
培養(yǎng)基混合）。人多潛能干細(xì)胞*培養(yǎng)基可在2 ~ 8℃穩(wěn)定儲存2周。
注：人多潛能干細(xì)胞添加劑需在室溫解凍，可按實際用量對添加劑進(jìn)行分裝，分裝后重新置于-80
~ -20℃保存，避免反復(fù)凍融。
細(xì)胞傳代條件：
當(dāng)滿足以下條件之一時需要進(jìn)行傳代：
?干細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上；
?干細(xì)胞集落過大，中央細(xì)胞生長不良；
?干細(xì)胞集落邊緣有開始分化的跡象。細(xì)胞傳代比例：
?通常早代次（<10代）的干細(xì)胞需要以較低的比例傳代，如1:2 ~ 1:4；成功建系的干細(xì)胞（10代以上） 可以1:6 ~ 1:10的比例傳代，傳代的比例由細(xì)胞株的生長速率決定。
?比較理想的傳代時間間隔是3 ~ 6天一次。
細(xì)胞傳代操作流程：
1.將人多潛能干細(xì)胞*培養(yǎng)基取出并平衡至室溫，取出包被好Matrigel的培養(yǎng)皿/瓶，吸去包被液并加入適量人多潛能干細(xì)胞*培養(yǎng)基，置于37℃恒溫CO 細(xì)胞培養(yǎng)箱中。
2.吸走待傳代細(xì)胞培養(yǎng)皿/瓶中的人多潛能干細(xì)胞*培養(yǎng)基，并且加入無鈣鎂的PBS溶液洗一次。
3.加入人多潛能干細(xì)胞消化液使之*覆蓋皿/瓶底。
4.37℃恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 ~ 6分鐘，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離皿/瓶底，克隆內(nèi)
部大部分細(xì)胞間出現(xiàn)較為明顯的間隙，肉眼觀察到細(xì)胞集落變得不透明且發(fā)白，表明細(xì)胞消化時間理想。
5.吸去消化液，即刻加入新鮮的人多潛能干細(xì)胞*培養(yǎng)基，用移液器扇形吹打培養(yǎng)皿/瓶底， 使皿/瓶底貼附的干細(xì)胞集落脫落，輕柔緩慢吹吸混勻。
注：吹吸的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)總共不超過10次為宜。吹打過度導(dǎo)致大量單細(xì)胞出現(xiàn)是造成細(xì)胞分化或死亡的重要原因。
注：如有少量細(xì)胞無法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。
6.顯微鏡下觀察細(xì)胞呈4 ~ 20個細(xì)胞大小的團(tuán)塊，水平十字搖勻。于室溫放置10 ~ 15分鐘。
7.顯微鏡下觀察到大部分克隆貼在皿底后將細(xì)胞置于37℃恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
8.每天換液直至達(dá)到可以傳代的標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞凍存
細(xì)胞凍存操作流程：
1.配制凍存液：90% 人多潛能干細(xì)胞*培養(yǎng)基+10% DMSO；將人多潛能干細(xì)胞*培養(yǎng)基取出并平衡至室溫。
2.吸走待傳代細(xì)胞培養(yǎng)皿/瓶中的人多潛能干細(xì)胞*培養(yǎng)基，并且加入無鈣鎂的PBS溶液洗一
次。
3.加入人多潛能干細(xì)胞消化液使之*覆蓋皿/瓶底。
4.37℃恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 ~ 6分鐘，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離皿/瓶底，克隆內(nèi)
部大部分細(xì)胞間出現(xiàn)較為明顯的間隙，肉眼觀察到細(xì)胞集落變得不透明且發(fā)白，表明細(xì)胞消化時間理想。
5.吸去消化液，即刻加入凍存液，用移液器扇形吹打培養(yǎng)皿/瓶底，使皿/瓶底貼附的干細(xì)胞集落脫落， 輕柔緩慢吹吸混勻。
注：吹吸的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)總共不超過10次為宜。吹打過度導(dǎo)致大量單細(xì)胞出現(xiàn)是造成細(xì)胞分化或死亡的重要原因。
注：如有少量細(xì)胞無法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。
6.按照復(fù)蘇所需要的量，1 ~ 5×106/mL，每管1mL凍存。
7.以1℃每分鐘的速率降至-80℃過夜（一般常見商品化程序降溫盒均可提供此條件）。
8.-80℃過夜后，將凍存細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮保存。細(xì)胞復(fù)蘇
細(xì)胞復(fù)蘇操作流程：
1.將人多潛能干細(xì)胞復(fù)蘇*培養(yǎng)基取出并平衡至室溫；取出包被過人多潛能干細(xì)胞鋪底工作液的培養(yǎng)皿/瓶，吸去包被液并加入適量人多潛能干細(xì)胞復(fù)蘇*培養(yǎng)基，置于37℃ 恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。
2.37℃水浴解凍細(xì)胞，小心搖晃使細(xì)胞融化至僅剩一小塊冰晶，迅速取出并用75%酒精消毒凍存管外表面，轉(zhuǎn)移至無菌操作臺中。
3.將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的15mL離心管中，緩慢加入4mL 人多潛能干細(xì)胞*培養(yǎng)基，輕柔吹吸2 次混勻。
4.200g離心5分鐘。
5.棄上清，加入適量人多潛能干細(xì)胞復(fù)蘇*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕柔吹吸2次混勻，并接種到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，顯微鏡下觀察細(xì)胞呈4 ~ 10個細(xì)胞大小的團(tuán)塊。
6.水平十字搖勻，于室溫放置10 ~ 15分鐘。顯微鏡下觀察到大部分克隆貼在皿底后，37℃恒溫CO2細(xì)胞
培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
7.棄掉人多潛能干細(xì)胞復(fù)蘇*培養(yǎng)基，加入新鮮的人多潛能干細(xì)胞*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天更換新鮮的人多潛能干細(xì)胞*培養(yǎng)基。
疑難解答：
?細(xì)胞復(fù)蘇率低是什么原因？
細(xì)胞復(fù)蘇需使用人多潛能干細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)基，可大大提高細(xì)胞的復(fù)蘇效率。復(fù)蘇過程中，轉(zhuǎn)移細(xì)胞、吹打混勻和重懸細(xì)胞時，吹打力度要輕柔，并盡量減少吹打次數(shù)，細(xì)胞接種后，即刻在鏡下觀察
細(xì)胞團(tuán)塊的大小，4 ~ 10個細(xì)胞的團(tuán)塊為最佳。如果吹打力度過大或次數(shù)過多，導(dǎo)致細(xì)胞分散成單細(xì)胞，
細(xì)胞復(fù)蘇率將偏低。
?培養(yǎng)基中有沉淀狀物質(zhì)是否是質(zhì)量問題？
添加劑在解凍過程中，會有少量沉淀析出，屬于正?，F(xiàn)象，不影響使用，請充分混勻后與基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合。但添加劑不能在37℃解凍，否則會析出大量沉淀，影響培養(yǎng)基的效價。如果培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量沉淀， 請不要使用。
?是否能在37℃反復(fù)水浴*培養(yǎng)基？
不推薦。頻繁地在4℃和37℃之間轉(zhuǎn)換會導(dǎo)致*培養(yǎng)基中含有的因子失活，*培養(yǎng)基在使用前放置至室溫即可。
?是否能用dispase酶或者膠原酶進(jìn)傳代？
在培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的人iPSC需用非酶的溫和消化方式傳代，用dispase酶或者膠原酶消化細(xì)胞會對細(xì)胞造成傷害，影響傳代后細(xì)胞的存活率和貼壁率。
?細(xì)胞消化后成了單細(xì)胞是什么原因？
人iPSC消化成小克?。?個以上20個以下的細(xì)胞聚集）進(jìn)行傳代最為適宜，消化為單細(xì)胞會短暫影響細(xì)胞的狀態(tài)。造成細(xì)胞消化成單細(xì)胞的原因有：
1.人多潛能干細(xì)胞消化液消化過度，需減短消化時間；
2.對細(xì)胞懸液吹吸的力度過重，或次數(shù)過多，需緩慢吸液與吹液，每皿/瓶的吹吸次數(shù)控制在10次以下。
?人ESC/iPSC在傳代后不貼壁怎么解決？
造成人ESC/iPSC傳代后不貼壁的最可能的原因：
1.細(xì)胞消化時間不合適；
2.消化后吹打次數(shù)不合適，使得完成傳代后細(xì)胞集落過大或過??；
3.消化時間不合適，把細(xì)胞強(qiáng)行吹打下來。
?人ESC/iPSC分化怎么處理？
1.細(xì)胞在剛復(fù)蘇或傳代時，小的細(xì)胞團(tuán)不呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的克隆形態(tài)，培養(yǎng)幾天或傳代后可恢復(fù)；
2.如果人ESC/iPSC分化的表現(xiàn)為干細(xì)胞克隆形態(tài)良好，克隆周邊出現(xiàn)散在的分化細(xì)胞，可通過高比例傳代（≥1:6），使得分化細(xì)胞的密度減少，低密度的分化細(xì)胞可被培養(yǎng)體系篩選去除， 如未*去除，可用細(xì)胞刮或巴斯德管刮除；
3.如果人ESC/iPSC分化的表現(xiàn)為克隆內(nèi)部松散，邊緣不平滑，在分化比例小或分化不嚴(yán)重的情況下， 可通過連續(xù)傳代2 ~ 3次恢復(fù)，如果分化嚴(yán)重，建議棄除。