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恒遠(yuǎn)分享免疫PCR試驗(yàn)材料及操作方法
閱讀：230 發(fā)布時(shí)間：2015-7-7| 提 供 商 | 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司 | 資料大小 | 43.5KB |
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一、生物素標(biāo)記特異性抗體的制備
免疫球蛋白(如IgG、IgM)的Fc片段上有糖基存在，因而可用能與糖基結(jié)合的Biotin-hydrazide作生物素標(biāo)記。
1.將純化的抗體(IgM或IgG，0.1~1.0ml)在標(biāo)記緩沖液(0.1Mol/L NaAc，pH值5.5，0.1Mol/L NaCl)中4℃透析放置一個(gè)晚上。
2.吸取0.5ml至微量離心管中，加過碘酸鈉溶液至終濃度為10mMol/L，置冰浴上于暗處孵育30min，使抗體分子上的糖基氧化。
3.將氧化的抗體過PBS平衡的Sephadex G25 PD-10預(yù)裝柱，使之與過碘酸鈉分開。收集蛋白峰。
4.向抗體管中加入Biotin-LC-hydrazide(Pierce)至終濃度5mMol/L，置混搖器上室溫孵育1h。
5.用含0.02%NaN3的PBS平衡Sephadex G25預(yù)裝柱，將生物素標(biāo)記的抗體分子過柱與游離的生物素分開。收集蛋白峰，保存-20℃。
二、生物素標(biāo)記DNA片段的制備
作為將與抗體偶聯(lián)的報(bào)告DNA片段，應(yīng)確保在待測抗原來源的機(jī)體DNA中無同源序列，如可選用大腸桿菌的序列作為報(bào)告DNA去檢測人源的標(biāo)本。DNA片段大小為300~500bp，生物素標(biāo)記可采用PCR方法，根據(jù)報(bào)告DNA的核苷酸序列合成一對引物，其中一個(gè)引物的5’端堿基上帶有生物素標(biāo)記。
在0.5mlPCR管中按表將下列試劑混合。
表PCR系統(tǒng)組成：
試劑 | 添加量 | 終濃度 |
10×PCR緩沖液 | 10.0ul | 1× |
2.5mM 4dNTP混合物 | 8.0ul | 0.2mM |
50uM生物素標(biāo)記的上游引物 | 1.0ul | 0.5uM |
50uM生物素標(biāo)記的下游引物 | 1.0ul | 0.5uM |
15mM模板DNA | 1.0ul | 1.0ug |
Taq DNA聚合酶 | 1.0ul | 5U |
加水至100uL
混勻后上面覆蓋液體石蠟。
95℃加熱5min，然后在PCR儀上按下列程序擴(kuò)增：94℃1min;55℃ 1min;72℃1min; 40個(gè)循環(huán)。zui后72℃延伸10min。
加等量酚-氯仿抽提，然后加10ul 3Mol/L Kac，250uL無水乙醇，置-70℃30min。
離心沉淀DNA片段，用70%乙醇洗一次。
將沉淀DNA干燥后溶于TE緩沖液中，保存在-20℃。
三、制備抗體-親和素-DNA復(fù)合物
將生物素標(biāo)記的抗體與親和素按等分子濃度混合于含有1mg/mlBSA的PBS中，室溫孵育30min，再加入兩倍分子濃度的生物素標(biāo)記的DNA片段，繼續(xù)孵育30min，zui后加入10倍分子濃度的生物素，將親和素分子上的結(jié)合部位飽和。zui后過凝膠過濾柱將復(fù)合物與未結(jié)合的單體分開，加入BSA達(dá)1mg/ml，分裝后凍存于-20℃。
四、免疫PCR
1.按常規(guī)ELISA方法，用飽和緩沖液稀釋抗原，加到96孔塑料板或0.5mlPCR管中，4℃放置一個(gè)晚上。
2.用PBS洗三次，然后每孔加200ul封閉液(PBS含10mg/ml BSA，1mg/ml魚精DNA)，室溫孵育30min。
3.用TETBS(其配方：20mMol/L EDTA，0.02%NaN3)洗三次。
4.將抗體-親和素-DNA復(fù)合物稀釋于含有1mg/mlBSA和0.1mg/ml魚精DNA的TETBS中，每孔加50ul，室溫孵育1h。
5.用TETBS洗5次，然后將塑料板或管倒置在吸水紙上拍打以控干水分。
6.每管中加50ulPCR反應(yīng)液，含有表成分：
試劑 | 添加量 | 終濃度 |
10×PCR緩沖液 | 5.0μl | 1× |
2.5mM 4dNTP混合物 | 4.0μl | 0.2mM |
50uM生物素標(biāo)記的上游引物 | 0.5μl | 0.5uM |
50uM生物素標(biāo)記的下游引物 | 0.5μl | 0.5uM |
15mM 模板DNA | 0.5μl | 1.5ug |
Taq DNA聚合酶 | 0.5μl | 2.5U |
加水至50μL
混勻后上面覆蓋液體石蠟。
95℃加熱5min，然后在PCR儀上按下列程序擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min。zui后72℃延伸10min。
每管取5ul作瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色后觀察結(jié)果，如在PCR時(shí)加入了放射性核素標(biāo)記，則可用X光片顯影。
亦可在凝膠電泳后做Southern-blot，用特異性探針雜交，進(jìn)一步提高其特異性和敏感性。