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核酸分離與純化的原則
閱讀：1116 發(fā)布時(shí)間：2014-3-21材料與方法的選擇
(一)材料與方法的選擇
臨床常見(jiàn)的標(biāo)本有血液，尿液，唾液，組織及培養(yǎng)細(xì)胞等；核酸分離與純化的方法非常多，如何恰當(dāng)?shù)厥占c準(zhǔn)備材料，選擇適宜的分離與純化方法是一個(gè)首要的問(wèn)題。首先我們應(yīng)當(dāng)明確核酸的分離與純化并不是zui終的目的，不同的實(shí)驗(yàn)研究與應(yīng)用對(duì)核酸的產(chǎn)量，完整性，純度和濃度可能有不同的要求；至于分離與純化核酸所需的時(shí)間與成本也往往需要考慮；在不影響核酸質(zhì)量的情況下，應(yīng)選擇安全無(wú)毒的試劑與方案。近年來(lái)，有關(guān)試劑盒的開(kāi)發(fā)與自動(dòng)化儀器的使用，能批量制備核酸樣品，大大提高了分離與純化的效率。
(二)選擇的原則
核酸分離與純化的方法很多，應(yīng)根據(jù)具體生物材料的性質(zhì)與起始量，待分離核酸的性質(zhì)與用途而采取不同的方案。無(wú)論采取何種方法，都應(yīng)遵循總的原則:一是保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性，因?yàn)橥暾囊患?jí)結(jié)構(gòu)是核酸結(jié)構(gòu)和功能研究的zui基本的要求；二是盡量排除其它分子的污染，保證核酸樣品的純度，這是本章討論的主要內(nèi)容。
(三)核酸完整性的保持
為了保證核酸的完整性，在操作過(guò)程中，首先應(yīng)盡量避免各種有害因素對(duì)核酸的破壞。影響核酸完整性的因素很多，包括物理，化學(xué)與生物學(xué)的因素，其中有些是可以避免的。如過(guò)酸或過(guò)堿，對(duì)核酸鏈中的磷酸二酯鍵有破壞作用，在核酸的提取過(guò)程中，采用適宜的緩沖液，始終控制pH在4～10之間，就可以很好地避免其危害；另外如高溫加熱，除高溫本身對(duì)核酸分子中的化學(xué)鍵的破壞作用外，還可能因煮沸帶來(lái)液體剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的條件下進(jìn)行。
其次對(duì)無(wú)法避免的有害因素，應(yīng)采取多種措施，盡量減輕各種有害因素對(duì)核酸的破壞。應(yīng)盡量簡(jiǎn)化分離純化的步驟，縮短提取的時(shí)間，減輕各種有害因素對(duì)核酸完整性的破壞；DNA酶(DNase或DNAase)的激活需要Mg2+，Ca2+等二價(jià)金屬離子，若使用EDTA，檸檬酸鹽并在低溫條件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶(RNase或RNAase)的廣泛存在與不易失活的特點(diǎn)，決定了生物降解是RNA提取過(guò)程中的主要危害因素。