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內(nèi)毒素檢測試劑盒說明

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顯色基質(zhì)鱟試劑盒使用說明書 終點(diǎn)顯色法,含偶氮化試劑)
 
【用途】顯色基質(zhì)鱟試劑 ( Chromogenic End-point Tachypleus Amebocyte Lysate ,
CE TAL )用于體外細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測,禁止以任何途徑進(jìn)入機(jī)體。
 
【原理】鱟試劑為鱟科動(dòng)物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的冷凍干燥品,鱟試劑中
含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在適宜的條件下(溫
度,pH值及無干擾物質(zhì)),細(xì)菌內(nèi)毒素激活C 因子,引起一系列酶促反應(yīng),
激活凝固酶原形成凝固酶,凝固酶分解人工合成的顯色基質(zhì),使其分解為
 多肽和黃色的對硝基苯胺(pNA,λmax = 405nm) 。在一定時(shí)間內(nèi),pNA的生成量與細(xì)菌  內(nèi)毒素濃度成正相關(guān),據(jù)此,可以定量供試品的內(nèi)毒素濃度。同時(shí), 對硝基苯胺(pNA)也可用偶氮化試劑染成玫瑰紅色 (λmax = 545nm),避免了供試品本身的顏色對405nm處吸收峰的干擾。
 
【檢測限】按反應(yīng)時(shí)間不同可檢測0.1EU/ml-1 EU/ml和0.01EU/ml -0.1EU/ml兩個(gè)區(qū)
間( 反應(yīng)時(shí)間T 1 和T 2 見出廠檢驗(yàn)報(bào)告) 。
 
【試劑盒組成】
細(xì)菌內(nèi)毒素工作品,2支
鱟試劑, 1.7ml/支,2支
顯色基質(zhì),1.7ml/支,2支
偶氮化試劑1,10ml/支,2支
偶氮化試劑2,10ml/支,2支
偶氮化試劑3,10ml/支,2支
HCl (反應(yīng)終止劑), 50ml/瓶,1瓶
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水,50ml/瓶,2瓶
 
【貯存】陰涼處, *2-8℃,避光貯存。
 
【用法】
1 .材料和設(shè)備
1.1 試劑
鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素工作品、顯色基質(zhì)、偶氮化試劑1 、偶氮化試劑2 、偶氮化試
劑3、HC l ( 反應(yīng)終止劑) 、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。
1.2器材
旋渦混合儀、移液器、多道移液器、封口膜、試管架。
恒溫水浴箱(37±1℃)、分光光度計(jì)。
注意:接觸試劑及供試品的所有器皿必須是無熱原的(我公司提供無熱原耗材)。
玻璃器皿可經(jīng)250℃干烤至少60分鐘去除熱原。
2. 供試品的貯存與預(yù)處理
 
備注:若供試品為血液類,請參照配套血液相關(guān)處理試劑使用說明書。
2.1供試品的pH值應(yīng)在6 - 8之間,若超出此范圍,需用無熱原緩沖液、0.1N氫氧化鈉或0.1N鹽酸調(diào)節(jié)。
2.2若供試品中可能存在鱟實(shí)驗(yàn)的干擾物質(zhì),處理參見【供試品的干擾試驗(yàn)】。
2.3若供試品中可能含有β-葡聚糖(β-葡聚糖會產(chǎn)生G因子旁路反應(yīng),干擾內(nèi)毒素檢測),需選用特異性鱟試劑(我公司提供)。
2.4若供試品為一些抗菌素如頭孢類抗菌素和磺胺制劑會對偶氮染色劑產(chǎn)生偶聯(lián)反應(yīng)而干擾偶氮化顯色,需要選用不含偶氮化試劑的試劑盒(我公司提供)。
2.5若供試品的本底吸光度值大于0.5,必須對供試品進(jìn)行稀釋后再檢測。
2.6若供試品顏色較深(例如溶血),或在酸性條件下顏色加深(例如一些組織培養(yǎng)介質(zhì)),必須設(shè)置供試品空白管以扣除供試品自身的顏色本底。
供試品空白管不加入鱟試劑,以等體積鱟試劑的溶劑(該處為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水)代替。其余操作同供試品管。
 
3.實(shí)驗(yàn)操作
3.1細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
標(biāo)準(zhǔn)曲線所采用的內(nèi)毒素濃度可以為0.01, 0.025, 0.05, 0.1 EU/ml或0.1, 0.25, 0.5,1.0 EU/ml。稀釋方法如下(以0.1, 0.25, 0.5, 1.0 EU/ml為例):取細(xì)菌內(nèi)毒素工作品1支,按細(xì)菌內(nèi)毒素工作品使用說明書稀釋為10EU/ml 的內(nèi)毒素溶液,再稀釋為1.0EU/ml的內(nèi)毒素溶液,以1.0EU/ml的內(nèi)毒素溶液為母液按下表稀釋成0.1,0.25, 0.5, 1.0 EU/ml的濃度梯度。配制好的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)用完。
表1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
內(nèi)毒素濃度(EU/ml)
1
0.5
0.25
0.1
加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(ml)
0
0.5
0.75
0.9
加1EU/ml內(nèi)毒素溶液(ml)
1
0.5
0.25
0.1
 
鱟試劑:按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于鱟試劑中,輕輕振搖使鱟試劑*溶解,
注意不要用旋渦混勻儀激烈振搖。溶解的鱟試劑應(yīng)在10分鐘內(nèi)用完。
顯色基質(zhì):按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于顯色基質(zhì)中,輕輕振搖使顯色基質(zhì)
*溶解。顯色基質(zhì)溶液可在無污染的條件下于4 ºC貯存8小時(shí)以內(nèi)。
偶氮化試劑1:按標(biāo)示量加反應(yīng)終止劑鹽酸于偶氮化試劑1中,
偶氮化試劑2:按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑2中,
偶氮化試劑3:按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑3中,
偶氮化試劑溶液可于4ºC貯存1周。
3.4實(shí)驗(yàn)操作
取無熱原試管,加入100ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,或供試品。
再加入100ml鱟試劑溶液,混勻,37ºC溫育T1分鐘。
溫育結(jié)束,加入100ml顯色基質(zhì)溶液,混勻,37ºC溫育T2分鐘。
溫育結(jié)束,加入500ml偶氮化試劑1溶液,混勻,
加入500ml偶氮化試劑2溶液,混勻
加入500ml偶氮化試劑3溶液,混勻,靜置5分鐘,于545nm波長處讀取吸光度
值。(見表2)
表 2 實(shí)驗(yàn)操作
 
陰性對照
內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)
供試品
加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(ml)
100
 
 
加內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(ml)
 
100
 
加供試品(ml)
 
 
100
加鱟試劑(ml)
100
100
100
混勻,37ºC溫育 T1 分鐘
 
 
 
加顯色基質(zhì)溶液(ml)
100
100
100
混勻,37ºC溫育 T2 分鐘
 
 
 
加偶氮化試劑1溶液ml)
500
500
500
 
4.數(shù)據(jù)處理
建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y = b X + a,其中
Y為545nm處吸光度值,X為內(nèi)毒素的濃度,b為直線斜率,a為Y軸截距。
當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同時(shí)滿足如下三個(gè)條件時(shí)實(shí)驗(yàn)才有效:
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r≥ 0.980,
2.標(biāo)準(zhǔn)曲線zui低點(diǎn)的Y值大于陰性對照的Y值,
3.供試品平行管的平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的區(qū)間內(nèi)。
【供試品的干擾試驗(yàn)】
供試品的干擾試驗(yàn)詳見《中華人民共和國藥典》2005版中《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》的
“光度測定法干擾試驗(yàn)”。當(dāng)鱟試劑、供試品的來源、配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)
環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí),須進(jìn)行干擾試驗(yàn),步驟如下:
1 選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度(設(shè)為λm),作為供試品干擾
試驗(yàn)中添加的內(nèi)毒素濃度,配制含λm內(nèi)毒素的供試品陽性對照,測量出該溶液
的內(nèi)毒素濃度,稱為Cs;
2 測量出未添加外源內(nèi)毒素的供試品溶液內(nèi)毒素濃度,稱為Ct;
3 計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率R=(Cs–Ct)/λm×100%
4 當(dāng)R在50%~200%之間,則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。
5 當(dāng)R在50%~200%之外,需對供試品進(jìn)行系列稀釋(稀釋倍數(shù)不得超過zui大有效
稀釋倍數(shù)MVD)或進(jìn)行其它處理消除干擾,每一稀釋溶液都重復(fù)步驟1-3,直到內(nèi)毒
素的回收率R在50%~200%之間。選擇回收率Rzui接近100%的稀釋倍數(shù)進(jìn)行內(nèi)毒
素檢測。

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