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【用途】顯色基質(zhì)鱟試劑 （ Chromogenic End-point Tachypleus Amebocyte Lysate ,

CE TAL ）用于體外細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測(cè)，禁止以任何途徑進(jìn)入機(jī)體。

【原理】鱟試劑為鱟科動(dòng)物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的冷凍干燥品,鱟試劑中

含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在適宜的條件下（溫

度，pH值及無干擾物質(zhì)），細(xì)菌內(nèi)毒素激活C 因子，引起一系列酶促反應(yīng)，

激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的顯色基質(zhì)，使其分解為

 多肽和黃色的對(duì)硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm） 。在一定時(shí)間內(nèi)，pNA的生成量與細(xì)菌  內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)，據(jù)此，可以定量供試品的內(nèi)毒素濃度。同時(shí)， 對(duì)硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化試劑染成玫瑰紅色 （λmax = 545nm），避免了供試品本身的顏色對(duì)405nm處吸收峰的干擾。

 

【檢測(cè)限】按反應(yīng)時(shí)間不同可檢測(cè)0.1EU/ml-1 EU/ml和0.01EU/ml -0.1EU/ml兩個(gè)區(qū)

間（ 反應(yīng)時(shí)間T 1 和T 2 見出廠檢驗(yàn)報(bào)告） 。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作品，2支

鱟試劑， 1.7ml/支，2支

顯色基質(zhì)，1.7ml/支，2支

偶氮化試劑1，10ml/支，2支

偶氮化試劑2，10ml/支，2支

偶氮化試劑3，10ml/支，2支

HCl （反應(yīng)終止劑）， 50ml/瓶，1瓶

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，50ml/瓶，2瓶

【貯存】陰涼處, *2-8℃,避光貯存。

 

1 .材料和設(shè)備

1.1 試劑

鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素工作品、顯色基質(zhì)、偶氮化試劑1 、偶氮化試劑2 、偶氮化試

劑3、HC l （ 反應(yīng)終止劑） 、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。

1.2器材

旋渦混合儀、移液器、多道移液器、封口膜、試管架。

恒溫水浴箱（37±1℃）、分光光度計(jì)。

注意：接觸試劑及供試品的所有器皿必須是無熱原的（我公司提供無熱原耗材）。

玻璃器皿可經(jīng)250℃干烤至少60分鐘去除熱原。

2. 供試品的貯存與預(yù)處理

2.1供試品的pH值應(yīng)在6 - 8之間，若超出此范圍，需用無熱原緩沖液、0.1N氫氧化鈉或0.1N鹽酸調(diào)節(jié)。

2.2若供試品中可能存在鱟實(shí)驗(yàn)的干擾物質(zhì)，處理參見【供試品的干擾試驗(yàn)】。

2.3若供試品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖會(huì)產(chǎn)生G因子旁路反應(yīng)，干擾內(nèi)毒素檢測(cè)），需選用特異性鱟試劑（我公司提供）。

2.4若供試品為一些抗菌素如頭孢類抗菌素和磺胺制劑會(huì)對(duì)偶氮染色劑產(chǎn)生偶聯(lián)反應(yīng)而干擾偶氮化顯色，需要選用不含偶氮化試劑的試劑盒（我公司提供）。

2.5若供試品的本底吸光度值大于0.5,必須對(duì)供試品進(jìn)行稀釋后再檢測(cè)。

2.6若供試品顏色較深（例如溶血），或在酸性條件下顏色加深（例如一些組織培養(yǎng)介質(zhì)）,必須設(shè)置供試品空白管以扣除供試品自身的顏色本底。

供試品空白管不加入鱟試劑，以等體積鱟試劑的溶劑（該處為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水）代替。其余操作同供試品管。

 

3.實(shí)驗(yàn)操作

3.1細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)曲線所采用的內(nèi)毒素濃度可以為0.01, 0.025, 0.05, 0.1 EU/ml或0.1, 0.25, 0.5,1.0 EU/ml。稀釋方法如下（以0.1, 0.25, 0.5, 1.0 EU/ml為例）：取細(xì)菌內(nèi)毒素工作品1支，按細(xì)菌內(nèi)毒素工作品使用說明書稀釋為10EU/ml 的內(nèi)毒素溶液，再稀釋為1.0EU/ml的內(nèi)毒素溶液，以1.0EU/ml的內(nèi)毒素溶液為母液按下表稀釋成0.1,0.25, 0.5, 1.0 EU/ml的濃度梯度。配制好的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)用完。

表1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

 

鱟試劑：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于鱟試劑中，輕輕振搖使鱟試劑*溶解,

注意不要用旋渦混勻儀激烈振搖。溶解的鱟試劑應(yīng)在10分鐘內(nèi)用完。

顯色基質(zhì)：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于顯色基質(zhì)中，輕輕振搖使顯色基質(zhì)

*溶解。顯色基質(zhì)溶液可在無污染的條件下于4 ºC貯存8小時(shí)以內(nèi)。

偶氮化試劑1：按標(biāo)示量加反應(yīng)終止劑鹽酸于偶氮化試劑1中，

偶氮化試劑2：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑2中，

偶氮化試劑3：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑3中，

偶氮化試劑溶液可于4ºC貯存1周。

3.4實(shí)驗(yàn)操作

取無熱原試管，加入100ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，或供試品。

再加入100ml鱟試劑溶液，混勻，37ºC溫育T₁分鐘。

溫育結(jié)束，加入100ml顯色基質(zhì)溶液，混勻，37ºC溫育T₂分鐘。

溫育結(jié)束，加入500ml偶氮化試劑1溶液，混勻，

加入500ml偶氮化試劑2溶液，混勻

加入500ml偶氮化試劑3溶液，混勻，靜置5分鐘，于545nm波長處讀取吸光度

值。（見表２）

表 2 實(shí)驗(yàn)操作

 

4.數(shù)據(jù)處理

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y = b X + a，其中

Y為545nm處吸光度值，X為內(nèi)毒素的濃度，b為直線斜率，a為Y軸截距。

當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同時(shí)滿足如下三個(gè)條件時(shí)實(shí)驗(yàn)才有效：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r≥ 0.980，

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線zui低點(diǎn)的Y值大于陰性對(duì)照的Y值，

3.供試品平行管的平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的區(qū)間內(nèi)。

【供試品的干擾試驗(yàn)】

供試品的干擾試驗(yàn)詳見《中華人民共和國藥典》2005版中《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》的

“光度測(cè)定法干擾試驗(yàn)”。當(dāng)鱟試劑、供試品的來源、配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)

環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn),步驟如下:

1 選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（設(shè)為λm），作為供試品干擾

試驗(yàn)中添加的內(nèi)毒素濃度，配制含λm內(nèi)毒素的供試品陽性對(duì)照，測(cè)量出該溶液

的內(nèi)毒素濃度,稱為Cs；

2 測(cè)量出未添加外源內(nèi)毒素的供試品溶液內(nèi)毒素濃度,稱為Ct；

3 計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率R＝（Cs–Ct）/λm×100%

4 當(dāng)R在50%～200%之間，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。

5 當(dāng)R在50%～200%之外，需對(duì)供試品進(jìn)行系列稀釋（稀釋倍數(shù)不得超過zui大有效

稀釋倍數(shù)MVD）或進(jìn)行其它處理消除干擾,每一稀釋溶液都重復(fù)步驟1-3,直到內(nèi)毒

素的回收率R在50%～200%之間。選擇回收率Rzui接近100%的稀釋倍數(shù)進(jìn)行內(nèi)毒

素檢測(cè)。