人生長激素釋放肽DHRP-GHrelin試劑盒

人生長激素釋放肽DHRP-GHrelin試劑盒，便是用于檢測生物樣本中 ghrelin 含量的工具，在科研及部分臨床診斷輔助方面意義重大。

一、檢測原理

二、試劑盒組成

1. 酶聯(lián)板：一塊 96 孔的微孔板，表面已包被抗 ghrelin 抗體。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：通常為凍干品，一般有 2 瓶。臨用前需以樣品稀釋液溶解并稀釋至特定濃度（如 1600pg/mL），再進(jìn)一步做系列倍比稀釋，得到不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，如 400pg/mL、200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL 等，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 。

3. 樣品稀釋液：用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品以及稀釋濃度過高的待測樣本，一般為 1×20mL 裝 。

4. 檢測稀釋液 A 和 B：分別用于稀釋檢測溶液 A 和檢測溶液 B，通常為 1×10mL 裝 。

5. 檢測溶液 A 和 B：檢測溶液 A 為 HRP 標(biāo)記的抗 ghrelin 抗體，檢測溶液 B 為與檢測溶液 A 配套的抗體溶液，均為濃縮液，臨用前需分別用檢測稀釋液 A 和檢測稀釋液 B 按 1:100 比例稀釋 。

6. 底物溶液：如 TMB 底物，為 1×10mL 裝，用于與免疫復(fù)合物中的 HRP 發(fā)生顯色反應(yīng) 。

7. 濃洗滌液：一般為 1×30mL 裝，使用時(shí)需用蒸餾水或去離子水按一定比例（如 1:25）稀釋，用于洗滌酶聯(lián)板，去除未結(jié)合的物質(zhì)，減少背景干擾 。

8. 終止液：1×10mL 裝，一般為 2N 的硫酸溶液，用于終止顯色反應(yīng) 。

9. 覆膜：5 張，用于在溫育過程中覆蓋酶聯(lián)板，防止液體蒸發(fā)和外界污染 。

10. 使用說明書：1 份，詳細(xì)介紹試劑盒的使用方法、注意事項(xiàng)、性能指標(biāo)等 。

三、樣本要求

1. 血清：采集全血后，將其室溫放置 2 小時(shí)或 4℃過夜，隨后以 1000×g 離心 20 分鐘，小心吸取上清液用于檢測。收集血液應(yīng)使用一次性無熱原、無內(nèi)毒素的試管 。

2. 血漿：可使用乙二胺四乙酸（EDTA）或肝素作為抗凝劑。標(biāo)本采集后，需在 30 分鐘內(nèi)于 2 - 8℃以 1000×g 離心 15 分鐘，取上清備用 。

3. 組織勻漿：先用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01M，pH = 7.4）沖洗組織，che底去除殘留血液（因?yàn)閯驖{中裂解的紅細(xì)胞會(huì)干擾測量結(jié)果）。稱取一定重量的組織并剪碎，按照約 1:9 的重量體積比（如 1g 組織對(duì)應(yīng) 9mL PBS，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整并記錄），將剪碎的組織與 PBS 加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后，將勻漿液以 5000×g 離心 5 - 10 分鐘，取上清用于檢測 。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：將細(xì)胞培養(yǎng)上清以 1000×g 離心 20 分鐘，去除雜質(zhì)及細(xì)胞碎片，取上清即可用于檢測 。

5. 其它生物標(biāo)本：如腦脊液、腹水等，一般以 1000×g 離心 20 分鐘，取上清進(jìn)行檢測 。

四、操作流程

1. 準(zhǔn)備工作：從冰箱取出試劑盒，提前 30 分鐘平衡至室溫，使所有試劑溫度與室溫一致。同時(shí)，將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水按要求比例稀釋備用。

2. 加樣：設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔?？瞻卓准尤?100μL 樣品稀釋液；標(biāo)準(zhǔn)孔分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液 100μL；待測樣品孔加入 100μL 待測樣本。加樣時(shí)，注意將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡，隨后用覆膜蓋住酶聯(lián)板，37℃溫育 120 分鐘 。

3. 洗滌：溫育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上，輕輕拍干。每孔加入 350μL 洗滌液，浸泡 1 - 2 分鐘后，甩去洗滌液，再次拍干。重復(fù)洗滌步驟 5 次，確保洗去未結(jié)合的物質(zhì) 。

4. 加檢測溶液：每孔加入 100μL 稀釋好的檢測溶液 A 工作液（臨用前配制），覆膜后 37℃溫育 60 分鐘 。

5. 再次洗滌：溫育完成后，按上述洗滌方法再次洗滌酶標(biāo)板 5 次 。

6. 加檢測溶液 B：每孔加入 100μL 稀釋好的檢測溶液 B 工作液，覆膜后 37℃溫育 60 分鐘 。

7. 第三次洗滌：重復(fù)洗滌步驟 5 次 。

8. 顯色：每孔加入 90μL 底物溶液，輕輕混勻，37℃避光顯色。顯色時(shí)間一般控制在 30 分鐘內(nèi)，期間需密切觀察標(biāo)準(zhǔn)品孔的顏色變化，當(dāng)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前 3 - 4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后 3 - 4 孔梯度不明顯時(shí)，即可進(jìn)行下一步 。

9. 終止反應(yīng)：每孔加入 50μL 終止液，輕輕混勻，此時(shí)溶液顏色由藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同，且底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液 。

10. 讀數(shù)：在加終止液后 15 分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀在 450nm 波長處測量各孔的光密度（OD 值） 。

11. 計(jì)算結(jié)果：以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。可使用專業(yè)的曲線制作軟件（如 Curve Expert 1.3 或 1.4），根據(jù)樣品的 OD 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的濃度，再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即為樣品中人生長激素釋放肽（ghrelin）的實(shí)際濃度 。

五、性能指標(biāo)

1. 檢測范圍：不同試劑盒有所差異，常見的檢測范圍為 6.25 - 400pg/mL 等 。

2. 靈敏度：一般可低至能檢測出 3pg/mL 甚至更低濃度的 ghrelin 。

3. 特異性：試劑盒對(duì)人生長激素釋放肽具有高度特異性，與其他結(jié)構(gòu)類似物如生長yi素、胰島素等幾乎無交叉反應(yīng) 。

4. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)（CV）通常小于 10%，板間變異系數(shù)小于 15% 。

5. 準(zhǔn)確性：通過對(duì)已知濃度的 ghrelin 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行多次檢測，測量值與理論值的偏差在合理范圍內(nèi)，一般回收率在 80% - 120% 之間 。

六、注意事項(xiàng)

1. 試劑盒從冰箱取出后應(yīng)平衡至室溫方可使用，使用后需立即按要求保存試劑，避免試劑反復(fù)凍融 。

2. 操作過程中應(yīng)使用一次性吸頭，避免交叉污染。加樣時(shí)，要確保吸頭垂直且深入孔底，避免液體掛壁或產(chǎn)生氣泡 。

3. 洗滌是關(guān)鍵步驟，不充分的洗滌易導(dǎo)致假陽性結(jié)果。若使用自動(dòng)洗板機(jī)，需提前熟練掌握其操作方法，并定期校準(zhǔn) 。

4. 底物溶液對(duì)光敏感，應(yīng)避光保存，使用過程中避免長時(shí)間暴露于光下。顯色反應(yīng)需在 37℃避光條件下進(jìn)行，且嚴(yán)格控制顯色時(shí)間 。

5. 終止液具有腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)小心，避免接觸皮膚和眼睛。若不慎接觸，應(yīng)立即用大量清水沖洗，并及時(shí)就醫(yī) 。

6. 建議所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣本均做雙份檢測，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，應(yīng)先進(jìn)行稀釋，再重新測定，計(jì)算結(jié)果時(shí)需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù) 。

7. 不同批次的試劑盒內(nèi)試劑不能混用，使用前應(yīng)仔細(xì)核對(duì)試劑盒的有效期和批次號(hào) 。

8. 試劑盒僅用于科研用途，不得用于臨床診斷 。