大鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白SP-A試劑盒

大鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白SP-A試劑盒，是科研中用于檢測(cè)大鼠樣本內(nèi) SP-A 含量的重要工具，助力肺部生理病理研究。

檢測(cè)原理

試劑盒組成

1. 酶標(biāo)板：已預(yù)先包被抗大鼠 SP-A 抗體，常見(jiàn)規(guī)格有 96 孔和 48 孔，如某些品牌 96 孔板為 12 孔 ×8 條，48 孔板為 12 孔 ×4 條，便于實(shí)驗(yàn)操作與根據(jù)樣本數(shù)量靈活選擇 。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：為已知濃度的 SP-A 凍干品或溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如，某試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 2000pg/mL，臨用前需用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液溶解，并進(jìn)行系列倍比稀釋，生成如 2000pg/mL、1000pg/mL、500pg/mL 等不同濃度梯度 。

3. 樣品稀釋液：用于稀釋樣本，保證樣本中 SP-A 濃度處于試劑盒可檢測(cè)的線性范圍，避免因濃度過(guò)高或過(guò)低導(dǎo)致檢測(cè)不準(zhǔn)確 。

4. 檢測(cè)溶液：包含生wu素化的抗 SP-A 抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素等。像檢測(cè)溶液 A 和檢測(cè)溶液 B，在使用前需用相應(yīng)檢測(cè)稀釋液按特定比例稀釋 。

5. 底物溶液：一般由底物 A 和底物 B 組成，如 TMB 底物溶液，二者等體積混合后在辣根過(guò)氧化物酶催化下發(fā)生顯色反應(yīng)，由無(wú)色逐漸變?yōu)樗{(lán)色，再經(jīng)終止液作用變?yōu)辄S色 。

6. 洗滌緩沖液：多為濃縮液，使用時(shí)需按一定比例用蒸餾水或去離子水稀釋。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用于洗滌酶標(biāo)板，去除未結(jié)合的物質(zhì)，降低背景干擾，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性 。

7. 終止液：通常為強(qiáng)酸溶液，如 2mol/L 的硫酸，用于終止底物的顯色反應(yīng)，使反應(yīng)體系顏色穩(wěn)定下來(lái)，便于酶標(biāo)儀準(zhǔn)確讀取 OD 值 。

8. 覆膜或封板膜：防止反應(yīng)過(guò)程中液體蒸發(fā)以及外界雜質(zhì)污染反應(yīng)體系，維持反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性 。

9. 使用說(shuō)明書(shū)：詳細(xì)闡述試劑盒的組成成分、實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟、注意事項(xiàng)、結(jié)果計(jì)算方法等內(nèi)容，為實(shí)驗(yàn)人員提供全面的指導(dǎo)，幫助其正確使用試劑盒 。

樣本處理

1. 血清：使用無(wú)熱原和內(nèi)毒素的試管收集大鼠血液，收集后將血液室溫放置 2 小時(shí)或 4℃過(guò)夜，促使血液充分凝固。隨后以 1000g 離心 20 分鐘，小心吸取上層清液，即得到血清。若不立即進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)將血清置于 - 20℃或 - 80℃保存，且要避免反復(fù)凍融，因?yàn)榉磸?fù)凍融可能影響 SP-A 的活性或?qū)е碌鞍捉Y(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而干擾檢測(cè)結(jié)果 。

2. 血漿：可選用 EDTA、檸檬酸鹽、肝素等作為抗凝劑。標(biāo)本采集后，需在 30 分鐘內(nèi)以 1000g 離心 15 分鐘，取上清液即為血漿。血漿的保存條件與血清一致 。

3. 組織勻漿：將大鼠相關(guān)組zhi剪碎，加入適量生理鹽水，使用組織勻漿器進(jìn)行勻漿處理，使組織細(xì)胞破碎，釋放出細(xì)胞內(nèi)的 SP-A。勻漿后，以 1000g 離心 30 分鐘，取上清液用于后續(xù)檢測(cè)。保存方式同血清，低溫保存并避免反復(fù)凍融 。

操作流程

1. 準(zhǔn)備工作：在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，提前將試劑盒從冰箱取出，平衡至室溫（20 - 25℃），切不可在 37℃快速溶解，以免影響試劑盒性能。同時(shí)，準(zhǔn)備好酶標(biāo)儀、微量加液器及配套吸頭、EP 管、蒸餾水或去離子水、濾紙等實(shí)驗(yàn)所需器材 。

2. 加樣：分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准尤霕悠废♂屢?100μl；標(biāo)準(zhǔn)孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 100μl；待測(cè)樣品孔加入經(jīng)過(guò)處理的樣本 100μl。加樣時(shí)要注意避免產(chǎn)生氣泡，將樣品緩慢加至酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，加樣完成后輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板，使樣品與孔內(nèi)溶液充分混勻。加樣結(jié)束后，給酶標(biāo)板加蓋或覆蓋封板膜，置于 37℃恒溫環(huán)境中溫育，溫育時(shí)間通常為 2 小時(shí) 。

3. 洗滌：溫育結(jié)束后，小心棄去孔內(nèi)液體，可通過(guò)甩干或輕拍酶標(biāo)板的方式去除殘留液體。每孔加入約 400μl 已按說(shuō)明書(shū)要求稀釋好的洗滌緩沖液，浸泡 1 - 2 分鐘后，再次甩干或拍干。重復(fù)該洗滌操作 3 - 5 次，務(wù)必確保che底去除未結(jié)合的物質(zhì)。若使用洗板機(jī)進(jìn)行洗滌，需嚴(yán)格按照洗板機(jī)的操作規(guī)程進(jìn)行操作，且洗滌次數(shù)應(yīng)適當(dāng)增加一次，以保證洗滌效果 。

4. 加酶標(biāo)試劑：每孔加入 100μl 檢測(cè)溶液 A 工作液（臨用前按要求配制），加完后再次給酶標(biāo)板覆膜，置于 37℃溫育 1 小時(shí)。溫育結(jié)束后，進(jìn)行洗滌操作，步驟同前。然后每孔加入 100μl 檢測(cè)溶液 B 工作液（同樣臨用前配制），覆膜后 37℃溫育 1 小時(shí)，之后再次洗滌酶標(biāo)板 。

5. 顯色：每孔加入 90μl 底物溶液（底物 A 和底物 B 按 1:1 等體積混合新鮮配制），加完后立即給酶標(biāo)板覆膜，在 37℃避光環(huán)境下進(jìn)行顯色反應(yīng)。顯色時(shí)間需嚴(yán)格控制，一般在 15 - 30 分鐘，當(dāng)觀察到標(biāo)準(zhǔn)孔的前 3 - 4 孔出現(xiàn)明顯的梯度藍(lán)色，而后 3 - 4 孔梯度不明顯時(shí)，即可終止顯色反應(yīng) 。

6. 終止反應(yīng)與讀數(shù)：每孔加入 50μl 終止液，終止反應(yīng)，此時(shí)溶液顏色會(huì)由藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序保持一致，以減少誤差。加入終止液后，應(yīng)立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的光密度（OD 值） 。

7. 結(jié)果計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的 OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的 OD 值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)的濃度，若樣品在檢測(cè)前進(jìn)行了稀釋，還需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，從而得到樣品中 SP-A 的實(shí)際含量 。

注意事項(xiàng)

1. 試劑盒保存：試劑盒應(yīng)始終在 2 - 8℃的低溫環(huán)境下保存，避免陽(yáng)光直射以及高溫環(huán)境。不同品牌的試劑盒保質(zhì)期可能略有差異，一般在 6 - 12 個(gè)月，使用前務(wù)必仔細(xì)檢查試劑盒是否在有效期內(nèi)，過(guò)期的試劑盒可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確 。

2. 樣本質(zhì)量：在采集樣本時(shí)，必須嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，避免樣本出現(xiàn)溶血、脂血或被微生物污染等情況。溶血樣本中釋放的血紅蛋白等物質(zhì)可能會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果；脂血樣本中的脂肪顆?？赡苡绊懳舛鹊臏y(cè)定，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。同時(shí)，樣本的處理和保存應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行，確保樣本中 SP-A 的活性和含量不受影響 。

3. 操作規(guī)范：嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，精確控制加樣量、孵育時(shí)間、洗滌次數(shù)和溫度等關(guān)鍵參數(shù)。加樣時(shí)應(yīng)使用經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)的微量加液器，以保證加樣量的準(zhǔn)確性；孵育過(guò)程中要確保溫育溫度的穩(wěn)定，可使用恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋，并定期對(duì)溫度進(jìn)行校準(zhǔn)；洗滌時(shí)既要保證充分洗滌，去除未結(jié)合物質(zhì)，又要注意避免過(guò)度洗滌，以免導(dǎo)致已結(jié)合的物質(zhì)被洗脫 。

4. 避免交叉污染：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)全程使用一次性吸頭、EP 管等耗材，堅(jiān)決避免不同樣本或試劑之間發(fā)生交叉污染。在吸取不同溶液時(shí)，要及時(shí)更換吸頭，特別是在吸取標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和不同試劑時(shí)，防止溶液相互污染，從而保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性 。

5. 底物和終止液使用：底物溶液對(duì)光較為敏感，應(yīng)避光保存，使用時(shí)要盡量快速操作，減少底物與光的接觸時(shí)間。終止液具有腐蝕性，在操作時(shí)要格外注意做好防護(hù)措施，避免接觸皮膚和眼睛，若不慎接觸，應(yīng)立即用大量清水沖洗，并及時(shí)就醫(yī) .