1. 原理

免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，熒光素受激發(fā)光的照射，由低能態(tài)進(jìn)入高能態(tài)，而高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來的低能態(tài)，這時發(fā)出明亮的熒光，利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。免疫熒光技術(shù)分直接法、間接法和補體法，zui常見的為間接法。

2. 常見熒光素特性

（1）異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）

 黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490－495 nm，發(fā)射光：520－530 nm，明亮的黃綠色熒光。

（2）藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）

 吸收光：490－560 nm，發(fā)射光：595 nm，紅色熒光。

3. 實驗步驟

（1）在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min；

（2）用4%的多聚甲醛固定爬片15 min， PBS浸洗玻片3次，每次3 min；

（3）用0.5%Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min（細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟）；

（4）PBS浸洗玻片3次，每次3 min；

（5）在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；

（6）吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；

（7）PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20－37℃孵育1 h；

（8）PBST浸洗切爬片3次，每次3 min；

（9）滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行復(fù)染核，PBST、5 min×4次洗去多余的DAPI；

（10）用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片；

（11）在熒光顯微鏡下觀察。

4. 注意事項
（1）熒光染色后一般在1 h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4 h，時間過長，會使熒光減弱；
（2）每次試驗時，需設(shè)置以下三種對照：
        陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物
        陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物
        熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物
（3）標(biāo)本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥；
（4）一抗和二抗應(yīng)始終保持在標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。

注意事項： 1.新鮮組織固定于4%多聚甲醛24h以上； 2.取材切面要平整，厚度不宜超過2mm； 3.請明確拍照部位及拍照倍數(shù)(一般為40X、100X、200X、400X)。