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賦能產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新！第四屆半導體超精密分析技術(shù)及應(yīng)用線上研討會報名開啟
1、刷型：
刷型手性色譜柱的出現(xiàn)和發(fā)展源于Bill Prikle及其同事的工作。六十年代，Bill Prikle將手性核磁共振中的成果運用到手性HPLC固定相研究中，通過不斷實踐，發(fā)明了應(yīng)用范圍較廣、柱效很好的手性色譜柱。刷型手性色譜柱是根據(jù)三點識別模式設(shè)計的，屬于Irving Wainer分類中的*種類型。
刷型手性固定相分為π電子接受型和π電子提供型兩類。zui常見的π電子接受型固定相是由(R)-N-3，5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸鍵合到γ-氨丙基硅膠上的制成。此類刷型手性色譜柱可以分離許多可提供π電子的芳香族化合物，或用氯化萘酚等對化合物進行衍生化后進行手性分離。
π電子供給型固定相常見的是共價結(jié)合到硅膠上的萘基氨基酸衍生物，這種固定相要求被分析物具有π電子接受基團，例如二硝基苯甲?；４碱?、羧酸類、胺類等，可以用氯化二硝基苯甲酰、異腈酸鹽、或二硝基苯胺等進行衍生化后，用π電子供給型固定相達到手性分離。
刷型固定相的優(yōu)勢在于其易于合成。合成方法在Bill Prikle的著作中有詳細的說明。另外，刷型固定相具有高的容量因子，因此具有高的選擇因子。它的不利之處在于它僅對芳香族化合物有效，有時不得不進行衍生化反應(yīng)。但值得一提的是，這種衍生化反應(yīng)是非手性衍生反應(yīng)，所以不存在手性衍生的問題。刷型手性色譜使用的流動相基本是極性弱的有機溶劑，這對于制備色譜來講未必是缺點。
近來，刷型固定相出現(xiàn)了π電子供給和接受基因的混合固定相。如：WHELK-O和BLAMO，及α-BURKE-Ⅱ固定相。α-BURKE-Ⅱ相十分適用于β-阻斷劑的手性分離。典型的流動相為二氯甲烷-乙醇-甲醇混合物，比例為85：10：5。加入10mM醋酸銨可以調(diào)整保留時間。SS BLAMO Ⅱ，同時具有π電子供體區(qū)和受體區(qū)，形成手性裂縫，因此對于某些分子具有很高選擇性。
2、纖維素型：
纖維素型手性色譜柱的分離作用包括相互吸引的作用及形成包埋復合物。它們屬于Wainer分類中的第2種類型。市售的手性色譜柱為微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基氨基酸鹽纖維素固定相。很多化合物可通過此類型的色譜柱得到分離。這種類型的手性色譜柱種類也很齊全。流動相使用低極性溶劑，典型的流動相為異丙醇-正己烷混合物。這類柱子根據(jù)制作工藝，分為涂敷與鍵合兩大類。但特別要注意由于氯可以使涂敷纖維素從硅膠上脫落，因此要確保涂敷類柱子流動相中無含氯溶劑。
3、環(huán)糊精型：
環(huán)糊精是通過BacillusMacerans 淀粉酶或環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶水解淀粉得到的環(huán)型低聚糖。通過控制環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶的水解反應(yīng)條件可得到不同尺寸的環(huán)糊精。市售的環(huán)糊精主要是α、β、γ三種類型，分別含6、7、8個吡喃葡萄糖單元。環(huán)糊精分子成錐筒型，構(gòu)成一個洞穴，洞穴的孔徑由構(gòu)成環(huán)糊精的吡喃葡萄糖的數(shù)目決定。
由于形成包合物速度較慢，因此可能導致色譜峰峰形較差，同樣也影響了其在制備色譜中的應(yīng)用。環(huán)糊精固定相的選擇性取決分析物的分子大小;α-環(huán)糊精只能允許單苯基或萘基進入，β-環(huán)糊精允許萘基及多取代的苯基進入，γ-環(huán)糊精僅用于大分子萜類。β-環(huán)糊精手性固定相應(yīng)用范圍zui廣。Ibuprofen通過β-環(huán)糊精色譜柱得到分離，說明了pH值對氫鍵的影響。當流動相的pH=7時，觀察不到拆分的跡象。pH=4時，可達到好的分離效果。通常分離氨基酸時，常采用低的pH值，以抑制酸性基團的離子化，同時也增強氨基的質(zhì)子化。磷酸三乙胺鹽、乙酸三乙胺鹽證明對β-環(huán)糊精色譜柱來說是很好的緩沖液。通常緩沖液是0.1%三乙胺溶液，用磷酸或醋酸調(diào)節(jié)到合適的pH值。高的流速會降低形成復合物的能力，低流速分離效果較好，0.5-1ml/min的流速。另外，增加緩沖液的濃度可以克服流速的影響，因為它可以增加環(huán)糊精洞穴和流動相的吸引力。
環(huán)糊精的修飾：zui近，對環(huán)糊精的修飾使環(huán)糊精型手性色譜柱可以分離更多的化合物，并可用于氣相手性色譜分離。衍生化是通過將不同的基因鍵合到環(huán)糊精洞穴表面的羥基上。衍生化反應(yīng)包括乙基化、S-羥基丙基化、生成S或R-萘基乙基氨基甲酸鹽、3，5二甲基苯基氨基甲酸鹽和環(huán)狀對甲苯酰酯。這些新型的環(huán)糊精固定相有許多優(yōu)點，它們可以分離更多化合物，價格上也有競爭力，由于改進了手性識別能力使其更適用于制備色譜。
4、配位交換型：
手性配位交換色譜(Chiral LigandExchange Chromatography，CLEC)由Davankov發(fā)明，是通過形成光學活性的金屬絡(luò)合物而達到手性分離，屬于Irving Wainer分類中的第4類手性固定相，主要用于分離氨基酸類。
由于此類固定相是由手性氨基酸—銅離子絡(luò)合物鍵合到硅膠或聚合物上形成，因此流動相中必須含有銅離子以保證手性固定相上的銅離子不至流失。其它的過渡金屬元素也已用于手性配位交換色譜，但銅離子應(yīng)用zui廣。形成絡(luò)合物的過程十分緩慢，因此有時需提高柱溫，*溫度約50℃。
手性配位交換色譜僅對α- 氨基酸和其類似物有效。β- 氨基酸很難用手性
配位交換色譜得以分離。手性配位交換色譜可用于制備，由于流動相中存在銅離子，雖然銅離子能用離子交換柱除去，但增加了樣品處理的困難。
5、大環(huán)抗生素型：
大環(huán)抗生素型手性色譜柱是zui近發(fā)展起來的，通過將大環(huán)抗生素鍵合到膠上制成的新型手性色譜柱。大環(huán)抗生素型手性色譜柱的出現(xiàn)歸功于Dan Armstron 的貢獻。此類色譜柱常用的大環(huán)抗生素主要由三種：利福霉素(Rifamycin)，萬古霉素(Vancomycin)，替考拉寧(Ticoplanin)。利福霉素作為手性添加劑在毛細管電泳分離手性化合物方面得到了成功運用。萬古霉素和替考拉寧分子結(jié)構(gòu)中存在“杯”狀結(jié)構(gòu)區(qū)和糖“平面” 結(jié)構(gòu)區(qū)。此類色譜柱性質(zhì)穩(wěn)定，可用于多種分離模式。手性分離基于氫鍵、π-π作用、形成包合物、離子作用和肽鍵等。
替考拉寧分子量為1885，結(jié)構(gòu)中存在20個手性中心，3個糖基和4個環(huán)。酸性基團在多肽“杯”/ “裂層”的一端，堿性基團在它的另一端。酸性基團和堿性基團提供了離子作用點。糖基在三個平面上，可折疊起來將化合物分子包埋在多肽“杯”中。
萬古霉素分子量為1449，結(jié)構(gòu)中存在18個手性中心，3個環(huán)。萬古霉素具有“籃狀”結(jié)構(gòu)，它的附近還有一個可彎曲的糖平面，可將分析物分子包埋在“籃子”中。羧基和仲氨基分布在“籃子”的邊緣，參與和分析物分子產(chǎn)生離子作用。萬古霉素手性色譜柱可用于反相模式、正相模式和極性模式。萬古霉素手性色譜柱可以分離胺類、中性酰胺、脂類。但對于酸性化合物選擇性較低。在反相模式中，有機相常用四氫呋喃、乙腈和甲醇。水相常用三乙胺-乙酸緩沖液。色譜柱適用的pH范圍為4-7。通常優(yōu)化堿性化合物手性分離條件時，選擇pH=7 為起點比較好。另外四氫呋喃、乙腈有的選擇性。有時采用純的甲醇和乙醇作流動相也可達到好的分離效果。萬古霉素手性色譜柱也可用正相模式，采用正己烷/乙醇為流動相。
萬古霉素手性色譜柱載樣量可以很大，非常適用于制備色譜。
6、蛋白質(zhì)型：
蛋白質(zhì)型手性色譜柱屬于第5種類型。分離依賴于疏水相互作用和極性相互作用。已經(jīng)有多種蛋白質(zhì)用于此類手性色譜柱。目前使用較多的是α-酸性糖蛋白(α-Acid Glycoprotein，AGP)，人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)和卵類粘蛋白(Ovomucoid，OV)。
α-酸性糖蛋白分子由181個氨基酸殘基和40個唾液酸(sialic acid)殘基構(gòu)成。α-酸性糖蛋白分子偏酸性，等電點為2.7。含有兩個二硫鍵，性質(zhì)很穩(wěn)定。α-酸性糖蛋白分子可以共價鍵合到硅膠上，制成手性色譜柱，可以分離許多化合物。
α-酸性糖蛋白手性色譜柱使用的流動相通常為pH 4-7的磷酸鹽緩沖液和很小比例的有機相。有機相異丙醇，如達不到分離要求，可以嘗試乙腈，乙醇，甲醇或四氫呋喃。有機相的改變導致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生暫時的改變。色譜柱的負載量至關(guān)重要，典型的負載量為0.02mg/ml的濃度樣品，進樣20μl。pH 的改變對手性選擇性起關(guān)鍵作用，尤其是胺類化合物。pH降低導致蛋白質(zhì)負電荷的降低，引起胺類化合物保留時間減小，然而這意味著可以減小有機相比例，使選擇性增加，峰形改善。
通過調(diào)節(jié)有機相比例仍無法達到分離效果時，有時需用電荷調(diào)節(jié)劑。但這可能引起蛋白結(jié)構(gòu)的*改變，這些電荷調(diào)節(jié)劑包括丁酸、辛酸、癸酸和二甲基辛胺。有時也用到1，2 亞乙基二醇，1，2丁醇和氯化鈉。溫度對分離也有影響，溫度增加保留時間，減小分離因子。
卵類粘蛋白由蛋清中提取，分子量為55,000。它可分離大量的胺類和酸類化合物。
蛋白手性色譜柱的載樣量均較小。影響了蛋白手性色譜柱在制備色譜中的應(yīng)用。
蛋白手性色譜柱在所有手性色譜柱中是應(yīng)用zui廣的色譜柱，但并不是效果的色譜柱。
7、冠醚型：
冠醚類固定相用于分離一級胺，一級胺必須質(zhì)子化方能達到分離。因此必須使用酸性流動相，如高氯酸。
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